肉种牛胚胎技术的应用

方焱秋,汪雪烨,顾达夫

长春新牧科技有限公司,吉林长春 130000

肉种牛胚胎技术的应用，可充分发挥优质种母牛的繁殖能力，扩大了良种畜群，缩短了优质种牛的育种时间，保存了优良种源，具有重大的实用价值，是现代畜牧业发展的重要领域之一。

本项目在长春新牧科技有限公司进行，我公司是目前国内较大的核心肉种牛繁育场，具有国内一流的基础设施设备，肉用种牛及技术队伍，公司有加拿大引进的优良的肉用种母牛214头，用于该项目的供体牛就从这些牛的纯繁后代中优选，有3个品种，即西门塔尔牛、夏洛来牛、利木赞牛，主要设备从德国引进，已具有独立开展这项工作的能力。

1 胚胎生产的工艺流程

1.1 对供体牛（良种个体）和受体牛（一般个体）用促性腺激素进行同期发情处理。

1.2 用促性腺激素对供体牛做超数排卵处理。

1.3 超数排卵的母牛在发情后，选择同种优秀的公牛进行配种或人工受精。

1.4 胚胎收集，把早期胚胎从供体母牛的子宫内冲洗出来（又称冲卵）。

1.5 冲卵后，对胚胎进行质量检查，这时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段。

1.6 将收集的胚胎直接向受体进行胚胎移植或胚胎冷冻，然后保存在-196℃的液氮中。

1.7 胚胎移植后对受体牛进行妊娠检查。

1.8 受体母牛分娩。

2 主要器械

检卵设备：实体显微镜、CO2培养箱、双蒸馏水器、高压灭菌器、恒温培养箱、鼓风干燥箱等。

移植器械：移植枪等。

药品：PBS液、FSH和HCG、PMSG、甘油、抗生素及消毒液。

其他：胚胎冷冻仪、液氮、液氮罐等。

3 具体操作

3.1 供体牛的超排处理

3.1.1 同期发情

人为控制母牛发情周期，使母牛集中发情，这是胚胎移植必须的方法。具体操作如下：优先挑选体格健壮的母牛，对其进行药物注射达到催情效果，肌肉注射垂体促卵泡素分4 d注射，每天2次，间隔12 h。第1天8 mL，第2天6 mL，第3天4 mL，第4天2 mL。在第3天追加一针氯前列醇皮剂。促使发情，配种后第一周对供体牛和受体牛集中超数排卵和达到供体、受体兼发情同期的目的，有利于提高移植后的受胎率。

3.1.2 超数排卵和冲胚

牛的卵巢含有几十万个卵母细胞，为此对供体牛进行超数排卵处理，取出妊娠早期胚胎，增加优良供体母牛后代，母牛发育周期的9～14 d肌肉注射PMSG；刺激卵巢产生额外的卵泡，诱导卵泡排卵，对超排处理的供体牛输精2～3次，间隔12 h，保证有足够的有效精子。根据供体牛的直肠检查情况，按照卵巢上黄体、卵泡和卵巢组织的发育情况，初步预测供体母牛的超排反应效果，一般黄体直径约2.5 cm左右发育好，有弹性，凸起明显，这时冲胚。冲胚液配制：冲卵液和胚胎的短期培养液，用改进的杜氏磷酸盐缓冲液，见表1。

表1 改进杜氏磷酸盐缓冲液成分

冲胚：本次采用非手术法收集胚胎。首先对牛只进行硬膜外麻醉注射，在尾椎和荐椎之间的缝隙注入10 mL的普鲁卡因。然后通过直肠探查，确定左右卵巢上的卵泡发育大小和数量，先冲洗卵泡数量多的一侧（左手做右侧卵巢冲胚，右手做左侧卵巢冲胚）。手指指尖靠拢呈锥形进入母牛直肠内，掏出直肠内多余宿粪，使直肠粪便排空。一只手力度轻缓适度，沿直肠内壁找到子宫颈，并使宫颈呈水平，另一只手将带金属芯的冲胚管向前推送，在直肠内的手准确摸到冲胚管，将冲胚管引导插入一侧子宫角，确定好位置，给气囊充气（20 mL）。用直肠内的手触摸气囊，固定冲胚管，抽出金属芯，先注入50 mL冲胚液，用直肠内的手隔着直肠对子宫角轻轻按摩，同时观察并收集回流的胚胎液，反复多次冲洗，收集足够的回流液体。此时借直肠把握，将金属内芯插入冲卵管放气，并把冲卵管从冲卵侧子宫角抽出，通过子宫体转向另一侧子宫角，重复以上操作。

冲胚结束后，宫腔用20支160万U的青霉素溶解到500 mL的0.9%Nacl中，冲洗宫腔。以避免宫腔感染，影响其后续的繁殖性能。

3.2 检胚技术

在20～25 ℃的无菌室内进行操作。

过滤集卵杯：回收到的冲胚液注入集卵杯过滤后，倒入画好方格的平皿中，并用冲胚液冲洗过滤网2～3次，也倒入平皿中待检。

检卵及净化：用实体显微镜从上到下、从左到右、沿方格线移动，做到不漏一处，将找到的胚胎用吸管吸出，并放在装有冲胚液的平皿中，待全部捡完后，进行胚胎的净化和等级鉴别。同一供体胚胎放在同一平皿中，做好牛号和胚胎数量标记。

3.3 胚胎鉴别

将冲胚液中的胚胎，置于高倍显微镜下，调整合适倍数直到看清胚胎，进行形态学检查，结合受精的日龄，观察其外形是否清晰，大小一致，均匀度和紧密性。胚胎发育速度和胎龄相一致为佳。胚胎主要分为3个生长时期：细胞期（0～5 d）,桑椹胚（5～7 d），囊胚期（6～11 d）。

胚胎分为A、B、C三个等级。A级为卵细胞分裂纹路清晰，形态均匀；B级为卵细胞分裂纹路清晰，形态略有变形；C级为卵细胞纹路不清晰，形态分布模糊。A、B级胚胎留用，C级弃去，C级胚胎与正常胚龄相比，发育迟2 d或2 d以上的，难以继续正常发育。

3.4 胚胎移植

3.4.1 鲜胚植入

供受体母牛做同期发情，受体牛不做配种，一般选品质较差或者品种不受市场欢迎的母牛，发情天数和供体母牛发情时间不超过24 h，做鲜胚植入的受体。致密桑葚胚、早期囊胚和囊胚分别植入6、7、8 d的受体母牛。

3.4.2 冷冻胚胎植入

先通过直肠检查，受体卵巢发育情况，确定母牛是否可植入胚胎，再解冻冷冻胚胎，冷冻胚胎解冻后，将细管内的溶液混合静置，缓慢将移卵管送至黄体侧的子宫角大弯或大弯深处，移植时动作要迅速轻柔准确。

3.4.3 冷冻胚胎与鲜胚差异

冷冻胚胎可长期保存，但受胎率比鲜胚低，鲜胚虽受胎率高，但不一定有足够的受体牛，因次长期冷冻保存。

结论：本公司对3个品种80头次超排处理，冲卵获得胚胎640枚，供体母牛平均每头回收胚胎8枚，其中可用胚胎6枚。生产优良胚胎，冷冻胚胎解冻复苏率达70%，冻胚移植妊娠率达45%，鲜胚移植妊娠率达60%。

项目完成后，极大的推动了肉牛胚胎生物技术在本公司的应用，加快了种牛繁殖速度，提高了种牛的优化能力和母牛的利用率，给公司带来了巨大的经济效益和社会效益。