大熊猫肠道菌群的研究进展

时云朵，孙 豪

（1.四川省水产学校，成都 611730；2.雅安市农业农村局，四川 雅安 625000）

大熊猫是中国特有珍贵野生动物，有“国宝”和“活化石”之称，被誉为野生动物保护领域的“旗舰物种”。自1869年定为新种后，便对大熊猫进行了多学科的研究，对其肠道菌群的研究可以追溯到20 世纪80 年代[1]。研究表明，肠道微生物对大熊猫消化吸收、代谢免疫和疾病等具有重要意义[2]。大熊猫本身不能分泌纤维素酶，其消化纤维素的功能主要由肠道微生物来完成[3]。此外，大熊猫肠道疾病被认为是其死亡的最重要原因之一，肠道微生态的改变可引起大熊猫消化功能紊乱甚至疾病[4]。因此，研究大熊猫肠道菌群及其生物学特性是筛选大熊猫益生菌的重要基础，对科学防治大熊猫肠道疾病、保护大熊猫种群具有重要意义。本文就大熊猫肠道菌群结构及其生物学特性进行综述。

1 大熊猫肠道菌群结构

以竹类为主食的大熊猫肠道却很短，没有瘤胃供食物发酵，且没有盲肠，类似肉食动物的消化道结构；且其肠道菌群与其他草食动物的肠道菌群大有不同，但类似熊的肠道微生态群[5]。这种类似肉食动物的消化道结构、熊样的肠道微生态以及类似草食动物的饮食特性决定了大熊猫拥有一个独特的肠道微生态。随着分子生物学和生物信息学的发展，对大熊猫肠道菌群有了更深层次的了解。

1.1 分离鉴定方法研究大熊猫肠道菌群结构

分离鉴定方法是早期研究大熊猫肠道菌群的主要方法。Hirayama等采用分离鉴定方法对大熊猫的粪便菌群进行研究，发现成年大熊猫的粪便菌群以链球菌和肠杆菌科细菌为主，专性厌氧菌较少，截然不同于其他动物；哺乳期的大熊猫粪便的优势菌是乳酸杆菌和链球菌，其次是双歧杆菌，但随着开始吃竹叶，粪便中乳酸菌数量减少，双歧杆菌逐渐消失，而肠杆菌科成为最主要的菌群之一；此外，雌性和雄性大熊猫粪便中优势菌群（链球菌）的种不同，提示不同性别的大熊猫粪便菌群存在区别[1]。彭真信等对3只健康大熊猫和1 只患慢性胃肠炎的大熊猫粪便菌群进行分析，发现4只大熊猫粪便中均未检出双歧杆菌，认为此菌不宜做大熊猫微生态制剂，且健康大熊猫粪便中优势菌群为大肠埃希菌和真杆菌，而在患病大熊猫粪便菌群中上述两类菌群明显偏高，认为大熊猫肠道慢性疾病可能与肠道菌群失调有关[6]。陈希文等对大熊猫肠道内容物的致病菌进行了选择培养，分离到19 株菌，其中优势菌为大肠埃希氏菌[4]。熊焰等对6只不同年龄的大熊猫全年粪便菌群进行分离鉴定，发现不同年龄段大熊猫的粪便菌群数量存在差异，且分离鉴定出16 种细菌，优势菌群为肠球菌、肠杆菌和乳杆菌，均为好氧菌和兼性厌氧菌[7]。周杰珑等对3只成年大熊猫的春季昼间粪便中可培养微生物进行细菌学鉴定，分离12株细菌，鉴定归为6属8种，其中优势菌是大肠杆菌和芽孢杆菌属[8]。分离鉴定方法虽在初步了解大熊猫肠道菌群结构和筛选大熊猫源益生菌中起到了非常重要的作用，但由于方法的局限性，结果可能存在较大误差。

1.2 分子鉴定方法研究大熊猫肠道菌群结构

分子鉴定方法是基于16SrDNA 扩增菌群核酸序列，最终以图谱形式进行展示、比较分析等反映菌群结构。鲁海峰等采用ERIC-PCR技术对3只大熊猫粪便菌群进行分析，发现不同个体间的粪便菌群结构比较相似，且同一个体在不同时期菌群结构稳定性较高[9]。Wei 等采用PCR-TGGE 技术对3 只大熊猫粪便菌群多样性、优势菌群及其动态变化进行分析，发现3 只大熊猫粪便菌群多样性高度相似，且两年间相对稳定，革兰氏阴性菌、兼性菌占到克隆库的60%[10]。王晓艳等通过16SrDNA-EFLP 及测序分析构建了3 只圈养老年大熊猫粪便细菌16SrDNA 克隆文库，发现其粪便菌群主要由变形菌门和厚壁菌门细菌组成，变形菌门中以大肠埃希氏菌属为主，厚壁菌门中以链球菌属为主，并发现一定比例的未培养细菌[11]。Peng等采用PCR-DGGE 技术和优势条带克隆测序方法对12 只（亚成年、成年和老年各4 只）圈养大熊猫粪便菌群的多样性、优势菌群进行分析，发现成年大熊猫粪便菌群多样性显著高于老年大熊猫，厚壁菌门和变形菌门细菌为优势菌群；并通过qPCR分析发现，成年大熊猫粪便中乳酸菌丰度显著高于其余年龄段大熊猫，且均未检出双歧杆菌[12]。由于大熊猫的特殊性，其粪便样品在研究其肠道菌群中扮演重要角色。Zhu等通过PCR技术分析了大熊猫粪便样品存储保护剂、储存时间等因素对微卫星实验的影响，结果发现直接冷冻的大熊猫粪便样品不宜用于微卫星实验，应选择含有乙醇等保护剂的样品[13]。为进一步探索大熊猫肠道菌群，赖婧等采用PCR-DGGE 技术对比分析了伪无菌小鼠（口服抗生素处理后的小鼠）定植大熊猫粪便菌群后的肠道菌群结构与大熊猫粪便菌群结构，初步建立了符合大熊猫肠道菌群特征的小鼠模型[14]。分子鉴定方法研究大熊猫肠道菌群，可以更快速、更多地检出一些现行条件下不能培养的细菌，进一步加深了对大熊猫肠道菌群结构的了解，但不能较全面的量化反映菌群结构及代谢关系等。

1.3 高通量测序方法研究大熊猫肠道菌群结构

近年来，随着二代测序技术的迅猛发展，高通量测序方法被广泛用于大熊猫肠道菌群研究中，使得对其肠道菌群有了更深入的了解。王立志等发现，大熊猫粪便菌群主要由变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和蓝藻门色球藻纲组成，变形菌门以埃希氏杆菌属/志贺氏菌属为主，厚壁菌门以梭菌属为主，拟杆菌门以稳杆菌属为主[15]。刘燕等比较分析了3只大熊猫（14、16月龄）的粪便菌群多样性及差异，发现14 月龄大熊猫的粪便菌群中乳球菌属比例高于16 月龄[16]。何永果等发现，与亚健康大熊猫比较，健康大熊猫粪便菌群中埃希菌属、梭菌属高，链球菌属低，菌群多样性为成年＞老年＞亚成体，认为健康状况和年龄对成年大熊猫粪便菌群结构影响较大[17]。晋蕾等发现，在大熊猫“培训→放归→野外”的过程中，其粪便细菌菌群丰富度和多样性差异不大，而真菌菌群的丰富度差异较大，认为大熊猫预放归过程肠道菌群不稳定，建议缩短预放归时间[18]。詹明晔等发现，上海市成体大熊猫粪便菌群多样性较四川省的更加丰富，两地成体大熊猫粪便优势菌群和特异菌群差异较大，且上海的有较高的芽孢杆菌属及山野壳菌科未知菌属[19]。Zhu 等发现，大熊猫粪便微生物组的物种丰度低于其他草食和肉食哺乳动物，其粪便菌群中具有编码纤维素酶等基因的梭菌纲菌群比例较高[20]。此外，Zhu 等对大熊猫、小熊猫、鹿等动物的肠道微生物基因组进行分析，发现大熊猫肠道中有较高比例的假单胞菌，认为大熊猫肠粪便菌群还有较强的氰化物降解作用[21]。高通量测序技术使人们对大熊猫肠道菌群及其生物学特性有了更深层次的了解，但菌群间、菌群与宿主间的相互作用机制，需要多学科、多组学进一步研究。

2 大熊猫肠道菌群的生物学特性

大熊猫肠道菌群的生物学特性主要是针对大熊猫源微生物的生物学特性研究，包括纤维素降解特性、益生特性和耐药性等方面，高通量测序方法从基因水平上了解肠道菌群对大熊猫消化、疾病等的影响。

2.1 大熊猫肠道菌群的纤维分解特性

以竹为主食的大熊猫是探讨微生物降解纤维素的重要研究对象，近年来，大量研究发现大熊猫粪便菌群具有纤维素降解能力。Zhu等发现，大熊猫本身的寡糖降解酶丰度与人类接近，纤维素酶和半纤维素酶丰度很低，而其粪便菌群中有纤维素降解作用的梭菌纲菌群比例较高，宏基因组进一步分析，发现粪便菌群含有编码纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、1,4-β-木糖苷酶木聚糖及1,4-β-木聚糖酶的相关基因，认为大熊猫肠道菌群在机体纤维素代谢中具有重要作用[20]。詹明晔等发现，与四川省相比，上海市成体大熊猫粪便菌群中含有更高比例的芽孢杆菌属和山野壳菌科未知菌属，且有更高的纤维素消化能力，认为不同地区成体大熊猫粪便微生物结构差异明显，对机体消化能力有一定的影响[19]。王海娟等归纳了大熊猫降解纤维素的初步机制，认为大熊猫肠道中的假单胞菌分泌的漆酶将竹纤维中的木质素氧化，暴露出纤维素，梭菌属、淀粉芽胞杆菌等分泌的纤维素酶将其降解为大熊猫可利用的糖类[3]。与之相反，Zhang等发现，大熊猫肠道菌群中含有较低丰度的木质素和纤维素降解编码基因，而淀粉和半纤维素降解编码基因丰度较高，认为大熊猫肠道菌群对纤维素和木质素的降解作用帮助不大，主要降解半纤维素[22]。Xue等发现，大熊猫肠道菌群与肉食性动物相似，认为以竹类食物为主的大熊猫似乎还未进化出符合高纤维饮食的肠道菌群[23]。Wei等通过宏基因组序列对比分析了大熊猫、肉食动物、草食动物及杂食动物的肠道菌群基因序列相关数据，也发现大熊猫肠道菌群功能与熊和肉食动物的更为相似，且纤维素、半纤维素消化酶基因丰度与肉食动物相似；通过体外酶活实验分析，发现大熊猫粪便中纤维素酶和木聚糖酶活性在食草动物中最低，认为大熊猫肠道菌群并不能高效降解竹中的纤维素和半纤维素[5]。因此，大熊猫肠道菌群对纤维素等的降解能力有待进一步研究。

2.2 大熊猫源候选益生菌的益生特性

筛选大熊猫源益生菌是研究大熊猫肠道菌群的一个重要方向，近年来，大量研究报道了大熊猫源益生菌的益生特性。王强等发现，从正常大熊猫粪便中筛选出的乳杆菌对大熊猫腹泻、肠炎、营养不良等疾病疗效显著，填补了大熊猫专用微生态制剂的空白[24]。在这之后，有研究者也从大熊猫粪便中分离获得植物乳杆菌，体外实验发现其在低pH 和高胆盐浓度下具有良好的稳定性，对肠毒素大肠杆菌K88的抗性较强，且对抗生素敏感[25]。小鼠体内实验发现其能抑制肠毒素大肠杆菌K88入侵小鼠肠道、改善肠道菌群结构，认为该菌可作为大熊猫源益生菌的候选菌株[26]。Zhou等分离一批大熊猫源芽孢杆菌属菌株，体外实验发现其均能抑制肠道致病菌，通过抗菌基因检测发现该批芽孢杆菌每菌株至少含有两种常见抗菌基因，认为芽孢杆菌的抗菌能力可能是大熊猫维持肠道菌群平衡的机制之一[27]。Zhou等也分离了一株大熊猫源枯草芽孢杆菌，该菌具有纤维素分解能力，能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，且此抗菌活性不随温度、pH、胰蛋白酶和胃蛋白酶浓度变化而变化，认为该菌有利于草食动物的肠道健康[28]。另外，Xiong 等分离了一株大熊猫源融合魏斯氏菌，体外实验发现该菌能在pH为2和0.3%（w/v）浓度的胆汁盐环境下存活，且能抑制常见的肠道病原体，认为该菌可作为大熊猫源侯选益生菌株[29]。从上述研究中发现，目前大熊猫源益生菌主要有乳酸杆菌、芽孢杆菌和魏斯氏菌3种，应用于大熊猫的只有一株乳酸杆菌。同时，对候选益生菌的研究大多停留在体外实验，体内实验较少，还未见有单菌测序分析的相关报道。

此外，耐药性也是大熊猫肠道菌群研究的一个关注重点。有研究发现大熊猫源大肠杆菌对氨苄西林、头孢唑林、四环素和复方新诺明等有较高耐药性，Ⅰ型整合酶基因在大肠杆菌中广泛存在，表明大熊猫肠道菌群的耐药性比较严峻，提示大熊猫疾病预防中要防止抗生素滥用，且应将耐药性作为大熊猫源益生菌筛选的指标之一[30]。

3 小 结

大熊猫独特胃肠道结构和饮食习性决定了其拥有一个独特的肠道菌群。目前已初步认识了大熊猫肠道菌群的基本构成，发现用药、年龄、季节、生活环境等因素可引起肠道菌群变化，并分离了部分益生特性较好的大熊猫源候选益生菌株，然而菌群间、菌群与宿主间的相互作用机制，菌群对纤维素等的降解能力及机制，以及肠道中真菌、古细菌、病毒等微生物的研究，均需多学科、多组学进一步研究[31-35]。此外，还应创新微生物培养方式，为获得更多大熊猫源益生菌，促进大熊猫微生态制剂临床应用创造条件。