Hippo信号通路在骨骼肌损伤修复中作用的研究进展

赵莉娟，张宏，张国辉，栗雅芳

上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437

骨骼肌是附着于骨骼上的横纹肌组织，通过其收缩和舒张可以带动骨与关节的活动，起到维持机体姿势并产生运动的作用。作为运动系统的重要组成，骨骼肌极易因内外力学环境的失衡而造成损伤，发生损伤的概率为10%～55%[1,2]。损伤类型主要为急性损伤(牵拉伤和顿挫伤)、慢性炎症性损伤。损伤后的骨骼肌若修复不良，后续常造成功能障碍和肌肉质量下降等，严重影响患者运动、工作和生活。骨骼肌细胞是一类具有再生能力的细胞，在损伤后可开启修复过程。而骨骼肌修复过程中激活某些信号通路可能会引发细胞外基质组分如胶原蛋白、纤连蛋白的大量沉积，进而发生纤维化，使损伤的骨骼肌丧失部分收缩功能，最终影响骨骼肌再生[3]。促进肌卫星细胞增殖，诱导肌卫星细胞以及成肌细胞的正常分化是损伤的骨骼肌再生修复的关键。其中有许多通路参与这一过程的调控，如Notch信号通路、Wnt信号通路均可促进骨骼肌肌卫星细胞的激活和分裂[4,5]。在成肌细胞增殖分化期间，成肌细胞的增殖往往伴随磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的参与[6]。同样，激活经典的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路也可促进成肌细胞的分化[7]，而酪氨酸蛋白激酶/信号转导因子和转录活化因子信号通路(JAK/STAT)中的JAK1-STAT1-STAT3途径不但可促进成肌细胞增殖，同时还起到防止成肌细胞过早分化成肌管的作用[8]。Hippo信号通路是由一系列保守激酶所组成的通路，可影响多种细胞分化、增殖和迁移，并在维持组织稳态，调控器官发育大小以及肿瘤的发生、发展过程等多方面均有重要作用[9]。近些年发现该通路还与骨骼肌损伤修复相关[10]。故本文对近几年的文献进行整理，并对Hippo信号通路在骨骼肌损伤修复中的作用进行分析，并归纳该信号通路与骨骼肌损伤后再生修复的关系，以期为康复医学提供有价值的参考。

1 Hippo信号通路概述

Hippo信号通路由上游STE20样激酶1/2(MST1/2)、Salvador同系物1(Sav1)、居于中游的与Mob同系物1(Mob1)结合的大抑癌基因激酶1/2(LATS1/2)、下游的转录辅助激活物Yes相关蛋白(Yap)及具有PDZ结合基序的转录共激活因子(Taz)组成[11]。该通路的激活过程是激酶的级联反应。MST1/2与调节蛋白Sav1相结合并形成MST/Sav复合体，随后参与磷酸化并激活与调节蛋白Mob1结合在一起的LATS1/2激酶；而LATS/Mob复合物又可进一步抑制Yap和Taz的活性。LATS/Mob复合物抑制下游转录辅助激活物，该作用是通过磷酸化Yap关键丝氨酸残基(Ser61、109、127、164和381)和磷酸化Taz关键丝氨酸残基得以实现。磷酸化后的Yap/Taz可从核内转出，留在胞质中参与之后的两种生物学过程。其一，磷酸化的Yap/Taz发生泛素化，直接导致Yap/Taz蛋白降解；其二，磷酸化的Yap也可与14-3-3蛋白结合后保留在细胞质中，从而无法与核内转录因子结合，发挥其转录辅助因子的功能[12]。通路去激活状态下，即激酶处于不活跃状态时，未被磷酸化激活的Yap/Taz则在细胞核内与DNA结合转录因子TEA结合域(TEAD)1-4结合，启动下游转录，进而完成复杂的生命活动。Hippo通路的核心元件Yap和Taz的活性，受通路核心激酶MST1/2-LATS1/2的激酶级联反应调控外，还受到蛋白质-蛋白质相互作用的破坏和蛋白翻译后修饰的影响[13]。

2 Hippo信号分子在骨骼肌中的表达

Hippo信号通路的关键成员是下游蛋白Yap，这是一种转录辅助因子，在细胞中都有表达。研究表明，该转录辅助因子参与多种成体干细胞或是祖细胞的增殖和分化，包括肠道祖细胞、肝卵圆细胞以及神经干细胞等[14,15]。近些年研究发现，Hippo信号通路的重要组件蛋白Yap和Taz在人及小鼠的骨骼肌卫星细胞和成肌细胞中也有表达。其中骨骼肌卫星细胞是一类具有间充质干细胞特性的细胞，而成肌细胞作为骨骼肌损伤后重建肌肉组织的前体细胞，具有很好的分化能力，二者均参与损伤骨骼肌的再生修复过程[16,17]。

3 骨骼肌的损伤修复

骨骼肌损伤后的修复过程大致分为三个阶段，并且这三个阶段之间没有明确的时间分割点，在过程中彼此存在一定的重叠性。第一阶段，坏死炎症阶段。损伤后的骨骼肌发生变性坏死以及肌纤维结构的破坏、炎症细胞的浸润(巨噬细胞为主)，吞噬坏死细胞的成分[18]。第二阶段，骨骼肌再生和重建阶段。这一阶段有一类参与骨骼肌再生的关键细胞——骨骼肌卫星细胞，该细胞位于骨骼肌肌膜与基底膜之间。一般情况下，骨骼肌卫星细胞处于一种静止不分裂的状态，损伤后骨骼肌卫星细胞会受炎症因子以及T细胞的刺激发生部分活化，活化的肌卫星细胞随后分化为成肌细胞，新的成肌细胞进一步分化形成肌管，成熟的肌管相互融合会形成新的肌纤维，完成整个骨骼肌损伤后的再生、重建过程[19]。第三阶段，损伤修复完善阶段。值得注意的是，在这一阶段修复的骨骼肌细胞可能会发生纤维化，主要是因为骨骼肌的修复过程后期需要成纤维细胞产生必要的细胞外基质，如果骨骼肌细胞反复而持续的发生变性、坏死、再生，最终会导致骨骼肌细胞细胞外基质大量沉积从而出现过度纤维化，丧失肌肉组织的部分收缩功能，最终影响肌肉力量和功能[3]。

4 Hippo信号通路在骨骼肌损伤修复中的作用及机制

4.1 促进骨骼肌卫星细胞和成肌细胞增殖 Hippo信号通路下游的核心构成元件是Taz与Yap，二者均具有促进成肌细胞和骨骼肌卫星细胞增殖的功能。研究表明，Yap活性及表达量处于较高水平时，可以促进卫星细胞增殖；在敲低Yap的表达后，由肌卫星细胞分化而来的成肌细胞增殖数量也会降低。这表明在骨骼肌修复过程中Yap的表达量增加，可更进一步促进被活化的肌卫星细胞增殖[10]。这一过程主要是由于Yap/Taz与核内转录因子TEAD结合后，激活成肌细胞或骨骼肌肌卫星细胞中的特定基因启动子MCAT元件，进而参与调控与DNA复制、有丝分裂以及DNA修复等相关基因的表达，影响骨骼肌细胞周期进程。其中发现Yap高表达时，可激活与细胞周期相关的基因如周期基因D1，而Yap可促进骨骼肌肌卫星细胞保持高度增殖活性可能也与之相关[20,21]。

有研究用一种可以增加细胞中未磷酸化Taz的化合物IBS008738表达后，增强了骨骼肌卫星细胞增殖期标志性基因的表达。这类增殖期标志性基因包括骨骼肌卫星细胞的特异性标记物Pax7及生肌决定因子(MyoD)。表明提高Taz表达量可起到促进骨骼肌卫星细胞的增殖的作用[22]。

与此同时，骨骼肌卫星细胞的功能调节因子表达同样依赖Yap参与调控，如骨形态发生蛋白4、跨膜糖蛋白CD34和生肌调节因子Myf6[10]。故Yap蛋白可参与调节骨骼肌卫星细胞的增殖和功能，为骨骼肌损伤后修复提供稳定的肌卫星细胞储备。同时，也有研究指出，Yap蛋白过度表达会造成骨骼肌卫星细胞持续保持增殖状态，从而无法进入分化阶段，不利于骨骼肌的修复。如在活化的骨骼肌卫星细胞中Yap的持续激活和过表达状态可引发胚胎性横纹肌肉瘤样肿瘤[23]。

4.2 调控成肌细胞分化 骨骼肌修复的后期，YAP的mRNA和蛋白表达量在骨骼肌分化过程中下降，并且Yap过表达后，发现可以抑制成肌细胞的终末分化[10]。在C2C12成肌细胞开始分化后，磷酸化的Yap-Ser127是C2C12成肌细胞实现终末分化所必需的，通过过表达人类Yap蛋白(hYAP1 S127A)突变体使未磷酸化的Yap的表达增多，显仅有较少C2C12成肌细胞离开增殖细胞周期，因而无法进一步分化成肌管[16]。值得注意的是，有研究用慢病毒敲低YAP的表达后，肌细胞正常行使收缩功能的肌球蛋白重链蛋白以及分化过程中充当启动子的肌细胞生成素表达量均降低，损害了成肌细胞向肌管的分化过程，并指出Yap调控成肌细胞分化是通过激活MEK5/ERK5信号通路得以实现[24]。提示，Yap也参与骨骼肌分化过程当中，而是否最终阻碍成肌细胞的分化取决于Yap的量和磷酸化的Yap-Ser127量。

在成肌细胞中，异位过表达Taz，可增加肌源性基因表达并加速肌管的分化以及进一步促进新生肌纤维的形成，而敲低Taz的表达后，却出现了分化延迟现象。使用新型Taz调节剂TM-53和TM-54后，发现调节剂可增加Taz的核定位，增强成肌细胞的分化。Taz可增强MyoD与肌细胞生成素基因启动子的相互作用，从而促进MyoD介导的肌源性基因表达[25,26]。同时值得注意的是，不适时的分化会造成激活的骨骼肌卫星细胞大量被消耗及成肌细胞过早分化成熟，同样会阻碍骨骼肌细胞的再生[27]。

4.3 调控骨骼肌蛋白合成 用Yap shRNA沉默肌肉中Yap蛋白的表达，结果显示肌肉质量和肌肉横截面积降低，说明Yap参与调控肌肉质量是通过影响蛋白质合成的过程得以实现[28]。有研究用一种新型化合物IBS008738以增加未磷酸化的Taz的表达，不仅增强了骨骼肌卫星细胞增殖期的标志性基因表达，同时也增加了蛋白质的合成，用以治疗小鼠的骨骼肌萎缩，说明Taz可以促进骨骼肌蛋白的合成[22]。对于调控骨骼肌蛋白合成过程，虽有结果证实增加Yap和Taz的表达量都促进骨骼肌蛋白的合成，有助于肌纤维质量的增加。但Yap过表达，却出现肌肉萎缩的现象，差异性的结果可能是在不同研究之间用于Yap过量表达的病毒载体以及Yap过量表达的时间存在差异所致[29,30]。

骨骼肌损伤作为运动系统的常见疾患，其损伤后的不良修复可引起肌肉功能的障碍，常影响患者日常工作生活，故骨骼肌损伤后的修复逐渐被人们所关注。其中损伤骨骼肌修复过程中有多条信号通路参与肌细胞的再生修复过程。研究发现在骨骼肌损伤的再生修复过程中，Hippo通路发挥了关键性作用。其中Yap和Taz表达量增多可促进参与损伤骨骼肌再生修复的卫星细胞及成肌细胞的增殖，并且应注意，在骨骼肌卫星细胞中Yap的过量表达，有诱发胚胎性横纹肌肉瘤样肿瘤的可能。Yap以及磷酸化Yap-Ser127参与调控修复后期的分化过程并取决于二者的表达量，而增强Taz表达可以促进骨骼肌成肌细胞的分化。在损伤骨骼肌修复过程中，诱导增加通路下游的Yap和Taz表达量可促进骨骼肌蛋白的合成，有助于骨骼肌纤维功能的恢复，并可用于治疗骨骼肌萎缩。损伤骨骼肌修复过程中，干预Hippo通路上关键蛋白的表达有望成为治疗骨骼肌损伤及影响骨骼肌肌肉质量疾病的重要治疗手段。