C-erbB-2和Ki-67表达阳性及阴性的乳腺癌超声造影定性及定量参数对比观察

徐平，杨敏，刘勇，吴兰英

首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，患病率和病死率均呈上升趋势，早期预测患者的预后有助于制定个体化治疗和检测治疗效果[1]。近年临床发现了很多可预示乳腺癌临床预后的生物学指标。C-erbB-2，也称为HER-2，是人类表皮生长因子受体家族的成员，可用作乳腺癌的诊断及指导治疗标志物[2, 3]。Ki-67是临床检测癌细胞增殖活性的敏感指标，可用于评估肿瘤细胞的增殖状态[4]。但目前临床检查癌组织C-erbB-2、Ki-67表达的方法是有创的，患者耐受性较差。超声检查可以对乳腺病变进行分析，超声造影(contrast-enhanced ultrasound ,CEUS)以一种非侵入方法观察微小血管的变化，评估肿瘤的血管生成。乳腺的良恶性病变在CEUS中表现均不同[5, 6]，而不同程度的癌性病变组织中C-erbB-2、Ki-67表达情况也不同。因此，我们分析不同C-erbB-2、Ki-67表达的乳腺癌患者癌组织CEUS病变参数变化，旨在为乳腺癌的治疗和预后评估提供新的依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月～2019年6月在我院治疗的乳腺癌患者88例，年龄31～74(50.40±9.22)岁。纳入标准：①均经病理学确诊为浸润性导管癌；②女性患者；③单发病灶；④CEUS检查前未行放化疗等抗肿瘤治疗；⑤患者及家属知情同意。排除标准：①合并有其他恶性肿瘤者；②有急慢性感染、免疫系统疾病、血液系统疾病等其他疾病者。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 癌组织C-erbB-2、Ki-67检测 采用免疫组化染色法。取88例患者乳腺癌组织标本。固定于10%甲醛溶液中，制作常规石蜡切片，厚5 μm，HE染色。免疫组化试剂分别是兔抗人C-erbB-2和Ki-67多克隆抗体(购自福州麦新公司)。用SP法进行染色，加DAB进行显色，最后在显微镜下观察。阴性对照则用磷酸盐缓冲液代替一抗。每个切片选取10个高倍视野，每张切片由2人双盲观测，判断标准[7，8]：癌细胞的细胞核染成棕黄色比例≥14%为 Ki-67表达阳性、<14%判为阴性。C-erbB-2以 SP 染色后细胞膜出现棕色颗粒着色阳性细胞数≥10%为+，着色阳性细胞数≥20%为 ++，着色阳性细胞数≥30%为 +++，其中“-”或“+”判为C-erbB-2表达阴性、“++”、“+++”判定为阳性。

1.3 乳腺癌患者CEUS检查方法 使用GE E9超声检查仪，患者仰卧位，使用9L线阵探头对乳房进行扫描，测量肿瘤最大径线。超声造影剂使用Sonovue。造影剂用5 mL生理盐水稀释后经肘静脉团注，用量为4.8 mL。选择病变血流最丰富的切面进行超声造影检查，至少持续3 min。观察乳腺癌造影剂的显像情况，并进行定性分析，获得下列定性参数：增强时间(快进、同进或晚进)、增强均匀性(均匀、不均匀)、增强范围(达峰后扩大、无扩大)、增强边缘(清晰、不清晰)、充盈缺损(有、无)；同时在病变增强强度最高的地方进行圆形取样，获取感兴趣区域的时间强度曲线，获得下列定量参数：峰值强度、达峰时间、曲线下面积。

2 结果

88例乳腺癌患者中C-erbB-2、Ki-67阳性表达分别为52、70例，阴性表达分别为36、18例。

C-erbB-2阳性、阴性表达者年龄分别为(49.39±8.28)、(51.03±9.80)岁，肿瘤直径分别为(2.10±1.03)、(2.02±1.18)cm，阳性患者TNM分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期分别为13、30、9例，阴性患者分别为11、19、6例。二者年龄、肿瘤直径及TNM分期比较差异无统计学意义。CEUS定性参数中，C-erbB-2表达阳性的乳腺癌患者表现为快进灌注、不均匀性增强、增强后病灶范围扩大、增强后边界不清晰、有充盈缺损例数分别为44、31、36、34、24例，C-erbB-2表达阴性者分别为19、21、23、22、18例，C-erbB-2表达阳性的乳腺癌患者快进灌注比例高于阴性表达者(P<0.05)。CEUS定量参数中，C-erbB-2阳性、阴性表达者峰值强度分别为(19.28±5.00)、(16.05±4.09)dB；达峰时间(13.30±2.39)、(15.19±2.31)s；曲线下面积分别为935.83±331.79、723.26±227.50。与阴性表达者比较，C-erbB-2阳性表达者峰值强度和曲线下面积高，达峰时间短(P均<0.05)。

Ki-67阳性、阴性表达者年龄分别为(51.02±8.92)、(49.40±9.10)岁，肿瘤直径分别为(2.05±1.19)、(2.09±1.10)cm，阳性患者TNM分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期分别为18、40、12例，阴性患者分别为6、9、3例。二者年龄、肿瘤直径及TNM分期比较差异无统计学意义。CEUS定性参数中，Ki-67表达阳性的乳腺癌患者表现为快进灌注、不均匀性增强、增强后病灶扩大、增强后边界不清晰、存在充盈缺损例数分别为51、42、46、44、38例，Ki-67表达阴性者分别为12、10、13、12、4例，Ki-67表达阳性的乳腺癌患者有充盈缺损比例高于阴性表达者(P<0.05)。CEUS定量参数中，Ki-67阳性、阴性表达者峰值强度分别为(18.67±3.22)、(15.99±4.03)dB；达峰时间(13.82±2.21)、(15.04±2.07)s；曲线下面积分别为825.10±304.42、742.29±308.83。与阴性表达者比较，Ki-67阳性表达者峰值强度和曲线下面积高，达峰时间短(P均<0.05)。

3 讨论

乳腺癌的生物学行为和组织病理学改变是图像诊断的基础，如何通过无创成像技术直接或间接客观地反映乳腺癌的预后因素，以及探索影像学表现与乳腺癌的预后因素之间的关系一直是国内外医务工作者的方向[7]。乳腺癌病变中异常分子的表达、微环境的变化以及肿瘤细胞的相互作用可导致组织的病理变化，从而导致影像中的独特表现[8]。常规超声及超声造影的表现均可能与分子免疫组化指标相关。

C-erbB-2与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGR)有一定相似性[9]。当C-erbB-2表达增多时会发挥VEGR样活性以促进微血管生成，使肿瘤继续生长和转移[10]。峰值强度表示在整个成像过程中达到最高峰时造影剂的强度，与病变内微血管密度相关；曲线下面积表示从初始强度的初始增强到最后增强的面积之和，可间接反映病变组织的血流量[11]；达峰时间代表从开始到达到最大峰值强度所花费的时间，短的达峰时间与异常血管形成相关，以上三个CEUS的灌注参数均与肿瘤血管生成的密度、程度和血流的灌注量有关。

本研究中我们采用癌组织免疫组化检测和CEUS来观察乳腺病变，结果表明，C-erbB-2阳性患者的快进灌注比例、峰值强度和曲线下面积较阴性者高，其达峰时间也较快。C-erbB-2的表达量越多，促使病变中的微血管密度越高，由于缺乏肌肉层，新血管形成较薄且容易变形，动静脉瘘易于形成，造影剂进入C-erbB-2阳性表达肿瘤的时间比周围正常的组织短，CEUS表现为定量分析短的达峰时间，定性分析为“快进”模式。

除了C-erbB-2与CEUS征象相关外，本研究还发现Ki-67阳性者有充盈缺损比例、峰值强度和曲线下面积高于Ki-67阴性者，而达峰时间明显快于阴性者。原因是Ki-67是与肿瘤细胞增殖相关的蛋白，表达越高，癌细胞增殖越快，Ki-67的表达加速了血管的生成过程[12]，致使病变组织中产生了不规则的滋养血管和血管内皮细胞，肿瘤中微血管密度更高，CEUS出现高峰值强度；肿瘤单位体积中的平均血流增加，CEUS定量分析时曲线下面积增大；乳腺癌对周围正常乳房组织的侵袭性增大，病灶周围信号增强[13]，同时，肿瘤的周围产生更多的肿瘤微血管，并且破坏了周围组织的抗侵袭屏障，这使其不断渗入周围组织[14]。恶性病变的边缘区域具有高度的增殖活性，并且生长模式通常以对周围正常乳腺组织的“蟹脚状”侵入性生长的形式。由于肿瘤微环境而导致“蟹足”浸润部分。肿瘤细胞的作用和相关肿瘤细胞的相互作用导致肿瘤细胞分泌大量的VEGF，从而引起病变周围大量的新生血管形成，CEUS增强后病灶面积增大[15]。Ki-67表达的乳腺癌病变微血管错综复杂，分布不均且曲折，肿瘤微血管形成跟不上肿瘤的生长速度，使得肿瘤组织的血供不足[16]，由于营养供应不足和缺氧，肿瘤的局部区域易于液化和坏死，CEUS表现为充盈缺损。

本研究分析了乳腺癌灶中C-erbB-2和Ki-67的表达与CEUS定性、定量参数的关系，并分析了两者之间的相关性。CEUS将在定量分析的基础上展示更多的临床应用前景。然而，关于血管造影特征与C-erbB-2和Ki-67的表达相结合的研究很少，因此需要进一步探讨其生理和病理过程。简而言之，将CEUS技术用于乳腺癌可以帮助影像医师使用超声来预测乳腺癌病情，减少患者的侵入性临床操作，为制定合理的治疗计划提供有用的信息。

综上所述，乳腺癌CEUS参数中快进增强、峰值强度、曲线下面积及达峰时间可能与C-erbB-2阳性表达相关，有充盈缺损、峰值强度、曲线下面积和达峰时间可能与Ki-67阳性表达相关。因此CEUS检查可作为一种辅助检查指导乳腺癌患者的治疗及评估预后。