分离自慢性肝病患者的62株泛耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测及菌株鉴定分型

杨耿侠，陈铭，栗光明

首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, AB)是一种细菌性病原体，在免疫功能低下患者中可导致严重感染。目前，AB已成为世界范围内重要的机会性院内感染病原体，特别是对于重症监护病房(ICU)的患者[1]。AB菌株极易对抗生素发生耐药。研究[2]发现，韩国的一所大学附属医院的AB菌株对美罗培南的耐药率高达32.5%。而且，多数碳青霉烯酶类耐药的AB多药耐药甚至泛耐药菌株。泛耐药(extensively drug-resistant)是指除多粘菌素、替加环素外，对临床所有一线抗生素均耐药[3]。AB对碳青霉烯类抗生素耐药发生机制中最常见的原因是OXA型碳青霉烯酶基因突变[4]。OXA型碳青霉烯酶基因突变主要有四种类型，分别为OXA-23、OXA-40、OXA-58、OXA-51。多数AB菌株中存在OXA-51碳青霉烯酶基因，因此OXA-51被认为是AB的固有基因。OXA-51型碳青霉烯酶能水解青霉素、碳青霉素类抗生素，但分解作用非常弱。目前临床发现，AB对耐碳青霉烯类抗生素耐药最常见的机制是OXA-23基因及其亚型突变，其耐药的发生可能与超广谱β-内酰胺酶(ESBLs，由PER-1基因、PER-2基因和VEB-1基因突变导致)、产金属β-内酰胺酶(MBLs，由VIM基因、IMP基因突变导致)、GES酶和氨基糖苷类修饰酶、外排泵、渗透性缺陷及耐药靶点改变有关[5, 6]。研究[7，8]发现，78.3%的碳青霉烯耐药AB菌株存在与OXA-23基因突变有关，其中ST22是最常见的多位点序列分型类型。多位点序列分型(MLST)是一种基于管家基因核酸序列测定的细菌分型方法，可用于多种细菌病原体的分型[9]。目前临床关于来自于慢性肝硬化患者的泛耐药鲍曼不动杆菌(XDRAB)分子流行病学特征相关报道较少。我们对62株XDRAB进行耐药基因及菌株分型检测，分析其分子流行病学特征，旨在为临床防控XDRAB提供数据支持。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集本院2012～2015年间保存的62株XDRAB，均经BD公司全自动细菌鉴定仪phoenix100(Becton,Dickinson and Company)表型鉴定为AB，且均为XDRAB(对阿米卡星、庆大霉素、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、头孢他啶、头孢吡肟等临床一线常用抗生素均耐药，对多粘菌素B敏感)，质量控制菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。62株XDRAB均来自于慢性肝病患者，其中男46例、女16例，年龄16～88岁，其中>50岁41例、≤50岁21例；患者来自ICU 40例、内科病房14例、外科病房7例；肝病类型为肝硬化35例、药物性肝损伤7例、肝移植术后6例、肝功能衰竭12例、肝癌2例；检测标本来自于痰38例、血液9例、腹腔积液5例、胆汁3例、尿液2例；血清白细胞、中性粒细胞水平较高，淋巴细胞水平较低，血红蛋白低;血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平高，白蛋白(ALB)水平低。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 XDRAB菌株耐药基因检测 采用RT-PCR法。 取冷冻菌株，复苏后提取DNA置于37 ℃培养箱培养18～24 h，挑取2～3个单个新鲜菌落，置于1.5 mL 离心管中,加入200 μL超纯水，配置菌液浓度为0.5个麦氏浓度，100 ℃煮沸5 min， 12 000 r/min离心10 min。取上清，-20 ℃保存备用。AB碳青霉烯类耐药OXA-51、OXA-23、GIM、OXA-58、IMP-R、VIM-2、OXA-24、VIM-1及SPMI基因的引物序列参照文献[5]设计，PCR反应体系：TaqPCR Mix酶25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、DNA模板4 μL、超纯水18 μL，反应条件为94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，30个循环后72 ℃、5 min。如菌株存在目的耐药基因表达，视为菌株存在耐药基因突变。

1.3 XDRAB菌株分型方法 采用MLST法。MLST应用于AB分型中时，常用基于保守区域305～513 bp序列的7个管家基因为gltA、 gyrB、 gdhB、recA、cpn60、 gpi和rpoD[10]。

取“2.2”中提取菌株DNA,扩增7个管家基因序列，测序后在GENEBANK中查找所对应的ST型,最终判定多态性分析的同源差异。7个管家基因片段经PCR扩增测序后，利用Blast算法同Pubmlst数据库中AB数据进行比对(http://pubmlst.org/abaumamiii/)，从而确定每个基因的基因型，最后结合7个基因型确定菌株ST型。

2 结果

62株XDRAB菌株中均存在OXA-51、OXA-23、GIM基因表达。62株菌株中存在OXA-58、IMP-R、VIM-2、OXA-24、VIM-1及SPMI基因表达的分别为51、35、22、17、15、14株，未见存在SIM-1基因表达菌株。

62株菌株MLST分型为ST381型、ST425型、ST492型、ST464型、ST191型、ST208型、ST218型分别为15、12、11、7、6、4、1株，有6株菌株出现未知ST型依次以STx1～STx4命名，其中STx1型、STx2型、STx3型、STx4型分别为3、1、1、1株。

3 讨论

近年来，头孢他啶和头孢噻肟、碳青霉烯和氟喹诺酮类等广谱抗生素的频繁使用与细菌病原体多药耐药性的增加有关[11]。碳青霉烯类抗生素以往被认为是治疗严重AB感染的首选药物。然而，碳青霉烯类耐药的AB在世界各地频繁出现。我们前期研究显示，出现院内感染的AB菌株存在高碳青霉烯耐药(亚胺培南和美罗培南耐药率均达到100%)。碳青霉烯酶、MBLs和一些苯唑西林酶是公认的AB碳青霉烯耐药的重要因素，OXA型碳青霉烯酶在耐药AB中已经成为主流，尤其是在全球爆发的OXA-23、OXA-40也已经在欧洲和美国发现。而天然携带的OXA-51酶被用作AB的鉴定。此外，产生OXA-58的AB菌株在意大利、比利时、法国、希腊、伊朗、美国和阿根廷发现[12]。

AB具有强大的获得抗生素耐药性能力，多药耐药(MDR)甚至泛耐药(XDR)的倾向给治疗和感染控制提出了挑战。在台湾，XDRAB的患病率从2002年的1.3%增加到2010年的41.0%，2008年-2009年亚洲MDR-AB和XDR-AB的发生率分别为82%和51.1%[13]。在泰国清迈的一家医院，在2005年XDR-AB感染的患病率是46.0%和在2008年XDR-AB 在外科ICU发生率30.6%[14]。由XDR-AB引起的VAP的发生率自2005年开始增加，直到2010年第1例在ICU中PDR-AB引起的VAP报道。MDR-AB感染的患者30天病死率是31.9%，而XDR-AB和PDR-AB死亡率分别增加到了56.8%和66.7%[15]。本研究中所有62株AB均对临床一线常用抗生素均耐药，包括：阿米卡星、庆大霉素、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星(CIP)、头孢他啶、头孢吡肟。但是，对多粘菌素B敏感。均为泛耐药AB。

本研究中，62株XDRAB菌株对5类抗生素全部耐药，仅对多粘菌素敏感。这称为XDR，所有菌株有内在OXA-51基因，支持AB的鉴定，另外，OXA-23和GIM基因在所有的AB菌株中被发现，GIM基因与金属β-内酰胺酶有关[16，17]。正如上面提到的，AB耐碳青霉烯常与β-内酰胺酶和MBLs有关在我们的研究中也得到证实。

耐碳青霉烯类抗生素的AB的出现被认为是临床相关抗菌素耐药性前哨事件。产生获得碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶，包括那些属于OXA-23、OXA-24和OXA-58，并且固有的β-内酰胺酶OXA-51增加是最普遍的耐碳青霉烯耐药机制[18]。OXA-23碳青霉烯酶基因的全球传播与特定的克隆有关，主要是鲍曼不动杆菌MLST数据库最大和最广泛的克隆株ST492。携带OXA-23 的AB菌株属于ST492已在许多国家被确定，包括澳大利亚、美国、中国、意大利、法国、塔希提岛、越南、新喀里多尼亚、泰国和南非[19]。此外，AB携带OXA-51、OXA-58或OXA-40基因，但分型属于ST492，已在日本、意大利和美国被报道[20]。本研究结果显示62株菌株主要主要ST型为ST381、 ST425 和ST492。携带OXA-23、OXA-51和 GIM基因的XDRAB主要属于ST381、ST425 和ST492三个基因型。ST492是可能导致AB对碳青霉烯类抗生素耐药率高的菌株分型，本研究结果中，36株菌株中存在ST492及ST469克隆，且多数菌株存在ST492克隆(17/19,89.5%)，同时还有7株菌株MLST结果属于新的STs型。这表明我院XDRAB主要流行菌株可能与其他地方不同。

肝病患者容易受到细菌感染是由于多种致病机制。肠道功能失调，细菌易位增加和免疫功能紊乱扮演重要的角色。细菌性腹膜炎和尿路感染是最常见的感染，还包括肺炎、皮肤和软组织感染、菌血症。肝病患者与感染的风险增加有关临床特征包括肝功能差、静脉曲张出血、低蛋白水平和住院治疗[21]。失代偿肝硬化患者细菌感染死亡的概率增加3.75倍，在1个月病死率达到30%，1年病死率63%。最近研究[22]报道,多个不同地区肝硬化患者耐药细菌所致感染的患病率增加，耐药细菌所致感染占院内感染23%～39%。本研究中，我们首对患者的临床资料进行分析后发现，存在肝硬化的患者占多数(59.32%)，近半数数患者存在肝功能异常，ALB异常患者超过70%。因此，抵抗力低、免疫功能差的肝病患者XDRAB感染类型与其他患者也可能存在差异。

综上所述，慢性肝病患者的XDRAB菌株主要耐药基因为OXA-23、GIM、OXA-58 和IMP-R，均未出现SIM-1耐药基因，主要ST型为ST381、ST425 和ST492。OXA-23、OXA-51和GIM基因是本院XDRAB介导临床耐药的主要基因型,因此我院应规范合理使用抗菌药物，减少不必要的侵袭性操作，预防XDRAB的暴发流行。