枯草期放牧东宝黑头羊瘤胃内环境参数及瘤胃细菌多样性分析

张 年，杨前平，陶 虎，熊 琪，李晓锋，陈明新，索效军

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064；2.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064）

反刍动物的瘤胃是一个复杂的生态系统，栖居有大量的细菌、古细菌、真菌和原虫，这些微生物可将植物性纤维转化为反刍动物能量，适宜的微生物群落环境对维持宿主营养物质消化吸收、生产性能及健康免疫至关重要［1］。细菌是反刍动物瘤胃中数量最多、种类最复杂的微生物，它们的生长代谢活动能够为动物提供能量、蛋白质、必需氨基酸和维生素等多种营养物质［2］。细菌受多种生理、饲料、环境等因素影响，而饲料是最主要的影响因素［3］，放牧山羊的营养来源主要是天然牧草，牧草质量可影响瘤胃中微生物种类及瘤胃内环境［4］，因此，揭示放牧条件下瘤胃微生物的差异，有助于了解粗饲料影响动物健康和生产性能的机理，亦可为饲用微生物的开发和提高牧草利用率提供依据。

东宝黑头羊是以波尔山羊为父本，麻城黑山羊为母本，采用导入杂交方法，历经10 余年培育的一个“黑头白身”新类群，主要饲养于湖北省西北部低丘岗地、江汉平原地区，以放牧为主，具有耐粗饲、耐湿热、性早熟等优点。目前对于东宝黑头羊的研究主要集中于资源调查及营养调控上，而对于瘤胃内环境调控及细菌多样性的研究鲜有报道。高通量测序技术已被广泛用于微生物生态学研究，其可全面客观地反映样品微生物的结构与组成。本试验拟对枯草期放牧东宝黑头羊瘤胃内环境参数及瘤胃细菌多样性进行研究，以期为揭示瘤胃细菌的调控机制和探索科学的补饲方法奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地点及试验设计

试验于2019 年12 月在湖北省荆门市岗东菀畜牧养殖专业合作社进行，该地区属亚热带温暖季风型气候，年降水量为949.4 mm，平均海拔150 m，年平均气温16.1℃，牧草生长期235 d 左右，一般11月开始枯黄，草地类型为湖滨草甸草场，优质牧草占地上生物量的比例为45%～50%，草地主要优势种为芒（Miscanthus sinensis）、白茅（Imperata cylindrica）、白羊草（Bothriochloa ischaemum）、假俭草（Eremochloa ophiuroides）等，伴生种为地榆（Sanguisorba officinalis）、委陵菜（Potentilla chinensis）、鸡眼草（Kummerowia striata）等。

选取6 只体重为（45.24±1.25）kg 的2 岁健康东宝黑头羊（公母各半）佩戴耳标，在荆门市东宝区湖滨草甸草场进行放牧。试验期间自由饮水、无补饲处理。

1.2 样品采集

1.2.1 牧草采集 分别将试验样地划分10 个样方（0.5 m× 0.5 m），采集样方中混合牧草地上生物量，除去不可食部分，将原始样品剪碎，于烘箱中65 ℃烘至恒重，粉碎过筛进行牧草营养成分的测定。

1.2.2 瘤胃液采集 按照耳标序号在上午放牧前，经口腔插管采集瘤胃液，每只羊采集瘤胃液40 mL，用4 层灭菌纱布进行过滤，立即进行瘤胃液pH 的测定，取约20 mL 用于氨态氮（NH3-N）和挥发性脂肪酸（VFAs）含量的测定，20 mL 备用，其中2 mL 用来进行DNA 的提取，分装完毕后立即贮存到液氮中，带回实验室备用。

1.3 样品测定

1.3.1 牧草营养成分 参考标准中的方法进行测定，其中干物质按GB/T 6435—2014 进行测定、粗蛋白质按GB/T 6432—2018 进行测定、粗脂肪按GB/T 6433—2006 进行测定、钙按GB/T 6436—2002 进行测定、磷按GB/T 6437—2002 进行测定、酸性洗涤纤维按NY/T 1459—2007 进行测定、中性洗涤纤维按GB/T 20806—2006 进行测定，测定结果见表1。

表1 枯草期牧草常规营养成分含量 （单位：%）

1.3.2 瘤胃内环境参数 瘤胃液pH 采用pHS-3C精密酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）进行测定；NH3-N 含量 采用冯宗慈等［5］的方法测定；VFAs 含量采用秦为琳［6］的方法，利用气相色谱（Agilent Technologies Inc. CA，美国）进行测定，测定条件：色谱分析柱为HP-FFAP 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA，美国），载气为高纯氦气（纯度不小于99.999%），流速1.0 mL/min，进样口温度260 ℃。进样量1 μL，分流进样，分流比10∶1，溶剂延迟2.5 min。程序升温：柱温箱的初始温度为80 ℃，以40 ℃/min 程序升温至120 ℃，10 ℃/min 升温至200 ℃，后运行至230 ℃保持3 min。

1.3.3 DNA 提取及MiSeq 测序 将冻存瘤胃液样品在4 ℃下溶解，轻微颠倒混匀，静置5 min，取上清液1 mL 转入1.5 mL EP 管中，采用FastDNA®SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美国）试剂盒和FastPrep TMFP 120 核酸提取仪，按照试剂盒说明书抽提瘤胃液中的细菌基因组DNA Nano-Drop-2000（Thermo，美国）测定DNA 浓度和纯度，利用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量，基因组DNA 于-20 ℃保存。

用带有barcode 的特异引物341F（CCTAYGGG RBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）来扩增细菌16S rDNA 序列的V3-V4 区。PCR 扩增在20 μL 体系中进行：4.0 μL 5×Fast Pfu 缓冲液，2.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL Fast Pfu 聚合酶；0.8 μL 正、反向引物（5 μmol/L）；10 ng 模板DNA，ddH2O 补至20 μL。PCR 扩增程序为：95 ℃5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min（PCR 仪：ABI GeneAmp®9700 型）。

使用2% 琼脂糖凝胶回收PCR 产物，用Axy-Prep DNA Gel Extration Kit（Axygen Biosciences 公司，美国）进行纯化，Tris-HCl 洗脱，PCR 产物经2.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，取鉴定正确的PCR 产物上机测序。采用Illumina 的TruSeq®Nano DNA Library Prep Kit 构建Illumina 测序文库，最后将质控的测序文库用Illumina MiSeq 平台进行2×300 bp双端测序，测序公司为上海美吉生物医药科技有限责任公司。

1.4 生物信息学分析

测序原始数据以FASTQ 格式保存，Miseq 测序获得的片段，经纯化、质控，并舍弃低质量序列（Read 尾部碱基质量小于20，质控后的Read 小于50 bp）后，用Usearch 7.1 软件进行OTU 聚类，以16S rDNA 序列97% 的相似度聚类获得多个分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）；然后在每个OTU 的序列中选取相对丰度最高的序列作为该OTU 的代表序列；将代表序列与RDP 数据库（http：//rdp.cme.msu.edu/）进行比对，采用RDP classifier（Ribosomal Database Program）鉴定OTU 代表性序列的微生物分类地位，并在各个分类水平（门、纲、目、科、属、种）统计每个样品的群落组成。样本群落α - 多 样 性 采 用Mothur 1.30.1 软 件（http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）进行分析。Ace 指数、Chao1 指数用于分析群落物种丰富度，Shannon 指数、Simpson 指数用于分析群落结构多样性。

2 结果与分析

2.1 瘤胃内环境参数

由表2 可知，东宝黑头羊瘤胃液pH 为6.65，NH3-N 浓度为50.30 mg/L，总挥发性脂肪酸（TVFA）含量为43.67 mmol/L，乙酸/丙酸为4.43，乙酸比例占TVFA 最高，为67.82%。

表2 枯草期放牧东宝黑头羊瘤胃内环境参数

2.2 OTU 聚类和α-多样性分析

经测序，6 份瘤胃液样品中共获得有效序列334 920 条，经质量控制后共得到优质序列290 868条，优质序列长度主要分布在431～475 bp，平均序列长度为455.17 bp，序列经拼接优化后，由表3 可知，根据97% 的相似度水平，对所有序列进行OTU 划分，共获得2 878 个，本研究平均每个样品OUT 数为479.67，Ace 指 数为523.31，Chao1 指数 为533.79，Shannon 指数为6.39，Simpson 指数为0.96，本次测序Coverage 为0.998，表示测序范围能涵盖绝大部分区域。

表3 枯草期放牧东宝黑头羊瘤胃细菌OTU 聚类和α-多样性指数

2.3 菌群结构分析

基于OTU 的分类结果，对东宝黑头羊瘤胃细菌共15 个门23 个纲29 个目34 个科87 个属进行鉴定，由图1 和表4 可知，在门水平，拟杆菌门和厚壁菌门占整个瘤胃微生物的91.37%，其中拟杆菌门（Bacteroidetes，75.75%）的相对丰度最高，厚壁菌门（Firmicutes，15.62%）位居第二，而变形菌门（Proteobacteria，3.66%）、柔膜菌门（Tenericutes，2.49%）相对含量也较高；在纲水平，拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）相对含量最多，分别占总菌的74.79% 和12.37%；在科水平，理研菌科（Rikenellaceae，45.89%）、普 雷 沃 氏 菌 科（Prevotellaceae，19.18%）和毛螺旋菌科（Lachnospiraceae，7.44%）为绝对的优势菌；在属水平，理研菌科RC9 肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group，45.64%）、普雷沃氏菌属1（Prevotella_1，15.46%）、普雷沃氏菌科未分类属（Unclassified，12.65%）是瘤胃中占主导地位的细菌，这些微生物在枯草期东宝黑头羊瘤胃消化牧草的过程中均起着重要的作用。

图1 瘤胃液中相对丰度较高的门、科、属

表4 不同分类水平相对丰度较高的瘤胃细菌

3 小结与讨论

本研究分析了枯草期放牧东宝黑头羊瘤胃内环境参数及瘤胃细菌多样性。结果证明，东宝黑头羊瘤胃细菌多样性较低；乙酸/丙酸比值较高；最优势菌门为拟杆菌门，其次是厚壁菌门；理研菌科RC9肠道群是东宝黑头羊瘤胃中最优势细菌属。

瘤胃微生物数目巨大、种类繁多，担负着多种生理功能，反刍动物通过瘤胃中微生物的发酵作用，将牧草分解为挥发性脂肪酸和氨等物质，给动物提供能量［4］；瘤胃内环境参数是反映瘤胃发酵状况的重要指标，包括pH、NH3-N 和VFAs 等主要参数，瘤胃pH 可起到稳定瘤胃内环境的作用，最适范围为6.5～7.0［7］，过低可诱发酸中毒，过高不利于瘤胃微生物生长，本研究中东宝黑头羊pH 为6.65，说明东宝黑头羊瘤胃有稳定的缓冲系统，发酵环境良好。NH3-N 浓度是最重要瘤胃氮代谢指标，可反映牧草瘤胃降解率与NH3-N 利用率间的变化，其含量直接影响微生物合成菌体蛋白的数量。研究表明，瘤胃中NH3-N 适 宜 值 为63～275 mg/L［8］，本 试 验 瘤 胃NH3-N 为50.30 mg/L，较适宜值偏低，推测牧草种类、蛋白质含量影响了东宝黑头羊瘤胃微生物生长的需要；VFAs 为反刍动物最重要的能源物质［9］，主要来源于瘤胃饲料碳水化合物的发酵，其产量和组成比例是评估发酵方式和能量转化的直接指标，VFA 主要由乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸组成，根据乙酸、丙酸、丁酸相对比例分为乙、丙、丁酸3 种瘤胃发酵类型，一般用乙酸/丙酸来表示瘤胃发酵类型的变化。在枯草期，牧草粗蛋白含量较低，纤维和结构性碳水化合物含量较高，在缺乏氮源的条件下，枯草期乙酸占比、乙酸/丙酸均升高，而挥发性脂肪酸含量降低［4］。研究发现，东宝黑头羊是典型的乙酸型瘤胃发酵，乙酸占TVFA 的比例为67.82%。研究发现乙酸/丙酸值适宜范围2.0～3.6，过高或过低都会影响瘤胃液pH 和饲粮消化率，进而影响动物的生产性能［10］；Brossard 等［11］研究发现，适宜的乙酸/丙酸可提高饲料利用率，放牧条件下，适当提高精料饲喂量可提高丙酸的浓度，降低乙酸/丙酸值。本试验乙酸/丙酸值为4.43，高于适宜范围，主要是由于枯草期放牧羊采食野生的灌木枝叶、荆棘和草本植物，而精料供给严重不足所致。此外研究发现，在放牧营养条件下，饲粮粗蛋白质含量需高于12% 才能满足微生物生长量的需要［12］，而本研究枯草期牧草粗蛋白含量仅为4.32%，这提示需在枯草期进行补饲，以增加精料摄入量，改善瘤胃内环境，提高其对劣质牧草的消化率，从而满足羊生长需要。

本研究6 个样本共获得优质序列290 868 条，OUT 数为479.67，低于川中黑山羊（947～1211）［13］；Ace 指数（523.31）低于川中黑山羊（793.03）、放牧蒙古羊（546.00），Chao1 指数（533.79）低于川中黑山羊（713.33）［14］、放 牧 蒙 古 羊（793.03）［15］，也 低 于 奶牛［16］、梅花鹿［17］、牦牛［18］等反刍动物，说明东宝黑头羊瘤胃细菌的丰富度和多样性相对较低。研究也发现，日粮成分越单一，瘤胃微生物多样性越低［19］。由于东宝黑头羊尚未大面积推广，养殖区域较为集中，枯草期牧草种类较少，可能是东宝黑头羊瘤胃菌群丰富度和多样性较低的重要原因，但这些差异与研究方法、肉羊品种、饲粮等之间的关联仍需作进一步研究。

本研究发现，在门水平，东宝黑头羊瘤胃最优势菌门是拟杆菌门（75.75%）、厚壁菌门（15.62%），这与陈芸等［13］阐述的川中黑山羊瘤胃细菌与曾燕等［20］阐述的蒙古羊瘤胃细菌组成相似，但相对丰度差异较大，推测可能是牧草物候期差异导致了本研究拟杆菌门数量大幅增加。在关于牛的研究中，放牧牦牛［4］、奶水牛［21］、锦江肉牛［22］拟杆菌门、厚壁菌门均为排名前2 位优势菌门，说明拟杆菌门和厚壁菌门在植物纤维降解过程中起重要作用［23］，影响着东宝黑头羊瘤胃的消化功能。在范文斌等［15］研究中，枯草期放牧蒙古羊瘤胃中的优势细菌种群为厚壁菌门（58.59%）和拟杆菌门（18.18%），在董春晓等［24］研究中，湖羊瘤胃相对丰度最高的为厚壁菌门（43.32%～53.14%）、拟杆菌门（33.59%～35.39%），与本研究结果存在较大的差异，可能跟羊品种、饲养环境不同有关。

在属水平，相对丰度最高的是理研菌科RC9 肠道群（45.64%），其作用是分解碳水化合物或降解蛋白质，但这种菌属作为第一优势菌群并不多见，普氏菌属（15.46%）是第二优势菌属，普雷沃菌属几乎可以单独完成瘤胃内所有饲粮成分的降解［25］。本研究结果与川中黑山羊［14］、锦江牛［22］、牦牛［4］、荷斯坦奶牛［26］等反刍动物瘤胃细菌优势菌属结构存在较大差异，具体原因尚不明晰，枯草期放牧东宝黑头羊主要以芒、白茅、白羊草、树枝等粗纤维含量高的植物为食，釆食条件恶劣，东宝黑头羊在选育过程中形成了耐粗饲的特性，但这种特性是否与瘤胃微生物菌属组成有关仍有待进一步探索。