蚯蚓对连作与轮作西瓜土壤细菌群落、微生物量和酶活性的影响

张翰林,郭惠宝,白娜玲,张娟琴,郑宪清,李双喜,张海韵,吕卫光*

(1 上海市农业科学院生态环境保护研究所,上海201403;2 农业部上海农业环境与耕地保育科学观测实验站,上海201403;3 上海市设施园艺技术重点实验室,上海201403;4 上海光明长江现代农业有限公司,上海202178)

我国西瓜种植面积居世界第一位,每年约在100 万—120 万hm2。 西瓜连作模式特别是大棚温室连作栽培,破坏了土壤微生态环境,引起有益菌种群结构的改变和数量降低,导致了严重的连作障碍[1-3],如何有效缓解连作西瓜土壤障碍已成为西瓜生产的当务之急,对保障食品安全、减少产地环境污染具有重大的理论和实际价值。 目前西瓜土壤连作障碍的防治与缓解措施主要有抗病品种培育,农业管理措施,化学防治和微生物防治[4-6]。 以上措施均具有一定的效果,但也均有各自的局限性,如时耗较长、投入品易造成二次污染等。 因此,开发生态高效的西瓜土壤连作障碍调控新方法,并对其调控效果进行研究具有十分重要的意义。

蚯蚓在改善土壤物理性状,促进土壤养分循环,调控土壤微生物群落结构与生态功能等方面均已有所报道,这为其修复农作物土壤连作障碍从理论上提供了可行性[7-8]。 目前利用蚯蚓开展连作障碍修复的研究主要是采用蚯蚓粪便或蚯蚓堆肥,Szczech[9]发现蚯蚓堆肥可有效抑制番茄病原体,其效果与蚯蚓堆肥添加量呈正相关,且蚯蚓堆肥中微生物发挥了主要的抑制作用;蚯蚓堆肥也可以显著降低西瓜与番茄枯萎病的发病率,改善果实品质[10];此外,添加蚯蚓粪也可以显著增加设施番茄、韭菜土壤三大菌的数量,提高土壤细菌多样性以及土壤酶活性[11]。 直接采用蚯蚓活体对连作障碍土壤进行修复目前尚处于试验性阶段,相关研究还并不多见。

本研究在西瓜连作土壤中接种蚯蚓,1 个月后分析土壤理化性质、土壤细菌群落多样性与酶活性,探讨接种蚯蚓对西瓜连作土壤障碍的修复改良作用,为修复连作西瓜土壤障碍开拓新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤来源:土壤来自于上海市农业科学院庄行试验站西瓜种植大棚,在2017 年6 月西瓜收获后取样。种植西瓜品种为早春红玉,障碍土壤取自3 年西瓜连作大棚内,大棚内西瓜产量已大幅减少30%—50%,轮作土壤取自旁边西瓜-蔬菜轮作大棚内,取样深度均为0—20 cm。 供试土壤类型为潮土。 试验所用障碍土壤基本理化性状:全氮3.1 g∕kg,全磷1.0 g∕kg,全钾6.2 g∕kg,pH 7.89,EC 0.11 mS∕cm,有机质18.7 g∕kg;试验所用轮作土壤基本性状:全氮2.9 g∕kg,全磷2.1 g∕kg,全钾11.8 g∕kg,pH 7.27,EC 0.66 mS∕cm,有机质37.4 g∕kg。

蚯蚓来源:试验品种为威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi),取自于上海市农业科学院崇明试验基地。 选取个体大小一致,质量在2 g 左右的成年蚯蚓进行试验。

试验容器:选用底部直径为20 cm、高为25 cm 的圆柱形铁桶作为试验容器。 底部打4 个孔,四周打8个孔,底部和四周打孔处内附50 目(筛孔孔径270 μm,下同)细纱网,容器上口同样采用50 目细纱网覆盖防止蚯蚓逃逸。

1.2 试验设计

为了研究蚯蚓接种密度对修复效果的影响,试验共设置6 个处理,分别为轮作土壤对照(NCK)、轮作土壤+500 条∕m2蚯蚓(N1)、轮作土壤+1 000 条∕m2蚯蚓(N2)和障碍土壤对照(DCK)、障碍土壤+500 条∕m2蚯蚓(D1)、障碍土壤+1 000 条∕m2蚯蚓(D2),每个处理设置3 个重复。 其中对照处理不接种蚯蚓,500 条∕m2蚯蚓处理每个试验容器接种15 条蚯蚓,1 000 条∕m2蚯蚓处理每个试验容器接种30 条蚯蚓。 保持试验温度在25 ℃,维持土壤表面湿度在65%—70%。

1.3 样品采集

在土壤培育1 个月后对将容器内土壤混匀后取样。 土壤一部分进行风干,测定土壤理化性质,另一部分土壤保存在-20 ℃,进行土壤DNA 提取及后续变性梯度凝胶电泳分析。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 土壤理化性质及酶活性测定

土壤总氮和速效氮均采用2 mol∕L 氯化钾溶液浸提,按照凯氏定氮法测定;总磷采用酸溶-钼锑抗比色法(5 mol∕L 硫酸浸提),速效磷采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定(0.5 mol∕L 碳酸氢钠溶液浸提);全钾采用氢氧化钠熔融法-火焰光度计法,速效钾采用乙酸铵提取-火焰光度计法测定(1 mol∕L 乙酸铵溶液浸提);土壤微生物生物量碳氮采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定[12];pH 采用电位法测定(水土体积比2.5∶1),有机质采用重铬酸钾容量法测定。

土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定,蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定,过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定[8]。

1.4.2 变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析

取0.5 g 土壤样品,使用Soil DNA Kit(50)(OMEGA)提取土壤DNA。 DNA 提取及纯化后采用0.7%琼脂 糖 凝 胶 检 验。 土 壤 DNA 采 用 细 菌 16 S rDNA 的 V3 区 通 用 引 物 F341GC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和R517(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)进行PCR 扩增。 PCR 采用25 μL 体系:10 ×PCR buffer 5 μL(with MgCl2),dNTP 0.5 μL,引物各0.5 μL,Tap 酶0.25 μL(250 U),模板1 μL。 采用降落PCR 策略[13]:96 ℃预变性5 min,之后94 ℃1 min,55—65 ℃1 min,72 ℃3 min,20 个循环,每个循环后复性温度下降0.5 ℃,后接94 ℃1 min,55 ℃1 min,72 ℃3 min,10 个循环,最后72 ℃延伸7 min。 DGGE 电泳采用8%浓度的聚丙烯酰胺凝胶,变性梯度为40%—60%,在60 ℃条件下,60 V 电泳12 h。 电泳结束后进行SYBR Green I 染色,用BIO-RAD 凝胶成像系统拍照观察。

1.5 数据处理

DGGE 图谱通过Quantity One 软件进行分析,采用其中的UPGAMA 程序进行微生物群落结构的聚类分析。 微生物群落多样性通过Shannon-Weaver 指数(H′)来表示,计算公式为:

式中,Pi为第i 个条带出现的概率,Ni为第i 个条带的序列扩增量,N 为所有条带的扩增总量(N =ΣNi),S 为DNA 序列丰富度指数,即单条泳道的条带数。

2 结果与分析

2.1 接种蚯蚓对连作西瓜土壤化学性质的影响

由表1 可知,接种蚯蚓处理均显著提升了连作土壤EC 和降低速效磷(P ＜0.05),其中1 000 条∕m2蚯蚓处理还可以显著提升连作土壤速效氮和速效钾(P ＜0.05)。 在轮作土壤中,接种蚯蚓均显著提升了土壤速效磷,降低了轮作土壤EC、有机质、全氮(P ＜0.05),1 000 条∕m2蚯蚓处理则还显著降低了土壤全磷,提升了土壤速效氮和速效钾(P ＜0.05)。

2.2 接种蚯蚓对连作西瓜土壤微生物量和酶活性的影响

经蚯蚓处理后,土壤微生物量碳氮在不同土壤中变化趋势相反(表2)。 在轮作土壤中,蚯蚓处理后微生物量碳氮与微生物碳氮比均有显著降低(P＜0.05)。 与NCK 相比,微生物量碳氮分别降低了18.0%—19.3%和15.7%—16.7%。 而在连作障碍土壤中,蚯蚓处理后微生物量碳氮均有显著提升,微生物碳氮比则同样显著降低(P＜0.05)。 与DCK 相比,微生物量碳氮分别提高了8.2%—11.4% 和68.9%—75.1%。 不同蚯蚓接种数量对土壤微生物量碳氮含量则没有显著影响。

表1 蚯蚓处理后土壤化学性质Table 1 Soil chemical properties after earthworm treatments

表2 蚯蚓处理后土壤微生物量碳氮Table 2 Soil microbial biomass carbon and nitrogen contents after earthworm treatments

蚯蚓处理后的土壤酶活性见表3。 蚯蚓处理后蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶酶活性均显著提高,与连作障碍土壤和轮作对照相比,蔗糖酶分别提高了69.4%—108.3%和26.0%—38.4%,脲酶分别提高了46.0%—71.8%和21.5%—42.6%,过氧化氢酶则分别提高了41.0%—59.0%和22.6%—46.1%。 且随蚯蚓接种数量的增加,三种酶活性也均显著提升(P＜0.05)。

表3 蚯蚓处理后土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities after earthworm treatments

2.3 接种蚯蚓对连作西瓜土壤细菌群落多样性的影响

基于DGGE 图谱,采用Quantity One 对其进行分析计算,得到土壤细菌群落的多样性指数H′(图1)。 与连作土壤和轮作土壤对照相比,蚯蚓处理提高了多样性指数H′,且1 000 条∕m2蚯蚓处理均高于500 条∕m2蚯蚓处理,但连作土壤经蚯蚓修复后,其细菌群落多样性依然低于轮作土壤对照处理。

对DGGE 图谱进行UPGMA 聚类分析的结果如图2 所示。 接种蚯蚓对西瓜土壤细菌群落结构影响显著。 N1 和N2 受蚯蚓的影响相似度最高,为78%,而在连作障碍土壤中接种蚯蚓使得细菌群落结构逐步趋近于轮作对照处理,D1 和D2 与NCK 的细菌群落结构相似度分别为58%和64%,DCK 则与其他处理差异最大,群落结构相似度仅为54%。

土壤细菌多样性指数H′、酶活性与土壤化学性质的相关性分析见表4。 细菌多样性指数H′与土壤速效氮(P＜0.01)、有机质、全氮、全磷(P＜0.05)呈显著正相关,过氧化氢酶、转化酶和尿酶的相关性分析结果一致,均与pH 呈显著负相关(P＜0.01),与速效氮呈显著正相关(P＜0.01)。

表4 土壤细菌多样性指数、酶活性与土壤化学性质的相关性分析Table 4 The correlation between H′,soil enzyme activities and soil chemical properties

3 结论与讨论

蚯蚓对土壤理化性质的影响显著,有研究显示,蚯蚓可显著降低盐渍化土壤EC,改良滨海农田土壤[14],促进土壤中磷素的分散化分布,增加土壤速效磷含量[15],这与本研究中蚯蚓对轮作土壤的影响相符。 作物连作易造成土壤养分不均衡,如氮素或磷素的过量积累[16],导致作物减产、抗逆性降低。 本研究中,与NCK 相比,DCK 速效磷含量提高了16.0%,出现了过度积累,而在EC、有机质、全量氮磷钾和速效氮钾则均显著降低。 在障碍土壤中接种蚯蚓,显著提升了EC、速效钾,并降低了由于连作而导致的过量速效磷含量,有效的平衡了土壤养分状况。 D2 与D1 相比,显著提升了速效氮含量,但整体土壤养分水平依然低于NCK。 土壤EC 代表了土壤水溶性盐的含量水平,与土壤养分矿化关系紧密。 一般来说,EC 在0.4—1 时最适宜作物生长。 接种蚯蚓后,由于其吞食过程,消耗了部分轮作土壤的水溶性盐,使其降低;但在连作土壤中,已经出现EC 过低的障碍情况(0.16),蚯蚓可能通过其吞食与挖掘活动,促进部分不溶性盐转化为可溶性盐,改善了土壤理化环境[14]。

土壤微生物量碳氮是反映土壤微生物数量与活性的重要指标[7]。 有研究显示蚯蚓由于吞噬作用和分泌黏液对部分微生物的抑制作用,导致微生物总量减少,降低了微生物量碳氮[17-18],这与本研究轮作土壤中结论一致。 也有研究发现,经过4 年田间小区定位实验后,蚯蚓会显著提升稻麦轮作系统土壤微生物量碳氮的水平[19],这可能是由于有作物根系参与其中,且实验的区域范围与时间长度都远远超过本研究。 在连作障碍土壤中,则可能是因为接种蚯蚓改善了土壤理化性质,平衡了由于西瓜连作造成的土壤养分失调(表1),改善了土壤理化条件,有效促进了土壤微生物生长,进而提高了土壤微生物量碳氮含量[20]。

土壤酶活性是衡量土壤养分循环能力的重要指标[7]。 陶军等[21]发现,秸秆还田条件下,接种蚯蚓显著提高了稻麦轮作土壤中的蛋白酶和蔗糖酶活性;郑宪清等[22]通过对利用蚯蚓进行生物耕作的菜田进行研究发现,土壤过氧化氢酶、蔗糖酶和脲酶活性均显著提高,且生物耕作的时间越长影响越大。 蚯蚓一方面通过改变土壤养分水平,如有机质、速效养分等,促进微生物活性提高,从而提升土壤酶活性。 在本研究中土壤酶活性与土壤速效氮含量显著正相关(表4),蚯蚓在提升土壤速效养分的同时,也增加了酶活性;另一方面,大量蚓粪的产生也带来了丰富的养分与微生物,这也是促进土壤酶活性提高的一个重要因素[11]。 本研究还发现,接种蚯蚓对连作障碍土壤酶活性的提升程度均高于轮作土壤,且D2 修复后土壤酶活性水平已经达到甚至超过NCK,表明接种蚯蚓可以有效缓解连作障碍造成的酶活性低下的情况。

连作西瓜土壤障碍的一个主要表现就是微生物群落多样性下降,细菌数量下降而真菌数量上升,导致微生物群落结构与功能失调[23],因此,改善土壤微生物群落结构有助于缓解土壤连作障碍。 本研究中,蚯蚓处理后,轮作土壤和连作障碍土壤中细菌群落多样性指数H′均有所提升,表明无论是障碍土壤还是健康土壤,蚯蚓均可以显著改善土壤细菌群落结构,与前人研究结果相似。 于建光等[24]发现,在红壤当中接种蚯蚓,微生物基质利用丰富度指数和多样性指数显著增大;Aira 等[25]在72 h 短期基质降解实验中也得到了相同的结论。 但连作障碍土壤经蚯蚓处理后,其多样性指数H’接近但还依然低于NCK,聚类分析也展示了类似结果,D1 和D2 处理细菌群落结构向NCK 趋近,尤其是1 000 条∕m2蚯蚓数量修复连作障碍土壤效果明显,但与轮作健康土壤细菌群落结构尚有一定差别。 本研究中,蚯蚓接种密度越大,其改善土壤理化及微生物状况的效果就越好,提升土壤速效养分,并正向的改变了土壤细菌群落结构。 但过高的蚯蚓接种密度可能会降低土壤全量养分,矿化速度过快,造成养分流失[26]。 在未来的研究中,一方面还需要应用宏基因组等手段,明确具体微生物群落结构差异种属及其生态功能,另一方面还需要在蚯蚓密度方面开展细化研究,探索改善障碍土壤的最佳接种密度,进一步为接种蚯蚓缓解西瓜连作土壤障碍提供理论基础。

综上所述,在西瓜连作土壤中接种蚯蚓可以显著改善由于连作造成的土壤养分失调、微生物数量降低、细菌群落结构受到破坏等障碍问题,蚯蚓接种密度为1 000 条∕m2时改善效果优于500 条∕m2。