离子色谱串联三重四极杆质谱测定婴幼儿配方乳粉和牛乳中的肌醇

王 岩，王 娟，吴春敏，张春林，王 东，高 镯，张雷雷，张 岩

（河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050000）

肌醇为环己六醇，分子式为C6H12O6，易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等，具有类似维生素的作用，最早由动物肌肉组织中提取，自然界中存在9 种肌醇的立体异构体，其中最常见是肌-肌醇[1]。肌醇常被作为食品营养强化剂添加到保健食品、功能饮料和婴幼儿配方食品中[2]，在婴幼儿配方乳粉中属于辅助添加性营养 物质[3]，根据G B 1 0 7 6 5—2 0 1 0《婴幼儿配方食品》 在婴幼儿配方食品中肌醇的添加量为1.0～9.5 mg/100 kJ，是人体必需的营养因子，在人体内以磷脂酰肌醇形式参与细胞膜的组成[4]，改善机体生长性能[5]，对婴幼儿脑部和毛发发育有重要作用[6]，以及参与脂肪代谢[7]、抑制肝脏脂肪堆积[8]等功能。

目前，对于肌醇检测常见的方法有酶法[9]、微生物法[10]、 气相色谱法[11-12]、气相色谱-串联质谱法[13-16]、离子色谱法[17]、液相色谱法[18]以及液相色谱-串联质谱法[19-21]、 毛细管电泳法[22]等，GB 5009.270—2016《食品中肌醇的测定》中方法为微生物法[23]和气相色谱法[24]，其中液相色谱法对复杂样品分离度较低[25]，微生物法时间较长，高锰酸钾氧化法损失较大，气相色谱法中样品通过前处理发生衍生[26]，再上机测定其衍生物含量，上述方法一般都存在前处理复杂[27-28]、回收效果不理想、测定周期长、检出限和定量限偏高等问题。目前鲜见采用离子色谱串联三重四极杆质谱法测定婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇的报道。

本实验采用离子色谱串联三重四极杆质谱法测定婴幼儿配方乳粉和牛乳中的肌醇含量，通过优化实验条件，建立适用于测定婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇含量的方法，该方法具有前处理过程简单、回收率高、检测时间短、检出限和定量限低等优点，实现肌醇快速检测，以期为检测婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇提供一种新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HCl（优级纯） 国药集团化学试剂有限公司；氨水、甲醇（色谱级） 德国Merck公司；IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱、0.45 μm滤膜（MCM） 博纳艾杰尔科技公司；肌醇标准物质（99.5%，200 mg） 上海安谱实验科技股份有限公司；乳粉标准参考物质QC-IP-707 中国检验检疫科学研究院测试评价中心；乳粉标准参考物质（SRM）1849a 美国NIST公司；超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

Dionex ICS-5000+离子色谱仪、Dionex ICS-5000+EG淋洗液自动发生器、Dionex ASRS 300电解再生抑制器、 Dionex AS-AP自动进样器、TSQ Endura三重四极杆 质谱仪 美国Thermo Scientific公司；VORTEX 3涡旋混匀器 德国IKA公司；3K15离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取婴幼儿配方乳粉0.50 g（牛乳样品1.00 g），于100 mL容量瓶中，添加15 mL超纯水溶解提取，充分振荡摇匀，用盐酸调节pH值到4.0～6.0，用超纯水定容至刻度，9 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液依次过0.45 μm滤膜、IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱，前2 mL滤液弃掉，进样小瓶收集过滤液，待测。

1.3.2 色谱条件

考察Dionex IonPac AS16、Dionex IonPac AS19、Dionex IonPac AS20、Dionex CarboPac PA1和Dionex CarboPac MA1五种色谱柱对目标物肌醇分离性和选择性的影响，并对不同浓度淋洗液进行选择。淋洗液流速0.50 mL/min，柱温30 ℃，进样体积20～50 μL，ASRS 300阴离子抑制器（2 mm，外接水模式）。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源；负离子多反应监测模式；离子源温度350 ℃；喷雾电压2 500 V；碰撞气流速0.15 mL/min；鞘气流速40 mL/min；辅助气流速10 mL/min；反吹气流速0.4 mL/min。

1.3.4 基质效应

采用同一水平浓度下样品基质溶液和标准品溶液中肌醇强度响应值的比值进行评估，对同一水平浓度样品进行6 次重复测定。计算公式如下：

式中：α为基质效应/%；γ0为样品本底响应值；γ1为标准品的响应值；γ2为样品中添加标准品的响应值。

1.3.5 标准溶液的制备

精准称取10 mg肌醇纯品固体于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到100 mg/L肌醇标准储备溶液；中间液为取1 mL肌醇标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到1 mg/L标准溶液；工作标准溶液是由中间液稀释得到。

1.4 数据统计及图表绘制

采用TSQ Endura 2.1 Tune和Xcalibur软件进行数据统计和处理，采用Origin pro8软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

在电喷雾离子源负离子模式下，优化肌醇检测的质谱条件，针泵连续进样，Q1全扫模式扫描母离子，碰撞母离子为m/z179.112，通过选择离子扫描模式，调整鞘气、辅助气和反吹气流速，分别得到子离子为m/z87.183和m/z117.054，采用信号稳定、灵敏度高的子离子m/z87.183为定量离子，经过条件优化最终选择的质谱条件如表1所示。

表1 肌醇质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters for inositol

2.2 离子色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的选择

选用Dionex IonPac AS16、Dionex IonPac AS19和Dionex IonPac AS20三种柱子时出峰不明显，杂峰干扰多，选用Dionex CarboPac PA1色谱柱时基线不稳，保留时间长，响应值偏低，初期出现杂峰，而选用Dionex CarboPac MA1色谱柱保留时间短，10～11 min附近出峰，能够实现快速分离检测，分离度好，峰形较为对称，基线低且平稳，出峰复现性好，因此，选择Dionex CarboPac MA1色谱柱（2.0 mm×250 mm，7.5 μm）作为分析柱，Dionex CarboPac MA1型保护柱（2 mm×50 mm）。

2.2.2 淋洗液的优化

在离子色谱分析测试中常见的淋洗液为碳酸盐溶液和氢氧根溶液，氢氧根溶液具有低背景和灵敏度较高的特点，氢氧根溶液通过抑制器会生成水相再进入质谱检测，对质谱的污染小，提高质谱的稳定性，因此，淋洗液用KOH溶液。本实验用KOH淋洗液自动发生器自动生成一定浓度的KOH溶液，避免了手工配制过程中空气中CO2溶于淋洗液造成的基线漂移。

实验采用梯度洗脱的方式，分别考察10、20、30、40、50 mmol/L浓度的KOH淋洗液对肌醇的分离洗脱效果。实验发现，使用10 mmol/L和20 mmol/L低浓度的KOH淋洗液时，目标峰宽较大，拖尾严重，响应值相对偏低，而使用30、40 mmol/L和50 mmol/L的KOH淋洗液时，峰宽变窄，响应值也有所提高，能够实现肌醇分离，但峰形对称性不好，峰形较宽，有拖尾现象，影响积分定量，低浓度时易受基线干扰，而采用梯度洗脱，可以改善峰形，峰宽变窄，响应值也有相应的提高，因此，采用梯度洗脱的方式，梯度程序见表2。

表2 KOH溶液梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program with KOH solution

肌醇属于弱极性化合物，在质谱中采用电喷雾电离时不易发生电离，出现响应值偏低、检出限高、灵敏度低等问题，为改善这些问题，采用外加水模式在淋洗液中加入0.01%氨水-甲醇溶液，能够明显改善电离强度，提高检测响应值和改善峰形。

2.3 样品前处理的优化

婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇为游离态的肌醇，可直接用水溶解提取，振荡摇匀，加酸使样液中蛋白析出，离心取上清液过0.45 μm滤膜、IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱，直接上机测定，样品前处理过程简单，避免待测目标物的损失和提高样品处理效率，样品前处理过程明显优于现行国家标准中对乳粉测定采用的气相色谱法。

2.4 基质效应

婴幼儿配方乳粉及乳制品中含有复杂的组成成分，尤其含有大量的油脂和蛋白质等有机大分子物质，为尽可能降低样品中的基质效应，本实验通过样品前处理优化，用盐酸溶液调节样液pH值，再将样液过滤膜和固相萃取小柱起到净化的作用，极大程度降低基质效应。

结果表明，肌醇的基质效应平均比值为95.3%，基质效应在可接受范围内，样品中的基质对肌醇的测定影响不大，能够保证结果的稳定性和准确性，因此本实验可忽略基质效应对测定结果的影响。

2.5 方法线性范围与检出限

用肌醇标准物质分别配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 μg/mL系列标准溶液，以肌醇定量离子对的峰面积为Y轴，系列标准溶液质量浓度为X轴进行线性回归，回归方程为Y=7 563.09＋315 926.4X，r＝0.999 8，线性良好。

称取不含肌醇的婴幼儿配方乳粉作为空白样品，加入一定浓度的肌醇标准溶液，当信噪比为3时的样品含量为检出限，当信噪比为10时的样品含量为定量限，因此，方法检出限和定量限分别为0.023 mg/100 g和0.076 mg/100 g，检出限和定量限均低于国家标准中固体或粉末样品检出限1.0 mg/100 g和定量限3.0 mg/100 g。

2.6 样品回收率与精密度

用本方法测定乳粉标准参考物质样品QC-IP-707（131.1 mg/100 g）和1849a（40.5 mg/100 g）（n=6）的回收率分别为99.1%和100.1%，如图1所示。向标准参考物质样品乳粉、婴幼儿配方乳粉和牛乳中按本底50%、100%和200%不同水平添加肌醇标准溶液，混匀静置1 h，按照1.3.1节前处理方法处理样品，样品回收率和精密度结果如表3所示。肌醇的加标回收率在90.3%～109.5%之间，相对标准偏差在0.7%～9.1%之间，满足婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇含量的分析要求。

图1 QC-IP-707（A）和1849a（B）中肌醇色谱图Fig. 1 Chromatograms of inositol in QC-IP-707 (A) and 1849a (B)

表3 不同添加水平下乳粉和牛乳中肌醇的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of inositol at different spiked levels in milk powder and milk samples (n = 6)

2.7 实际样品的测定结果

市场随机购买10 批次婴幼儿配方乳粉和牛乳，采用该方法检测其中肌醇含量，结果如表4、图2所示。结果说明不同品牌的婴幼儿配方乳粉之间肌醇含量存在一定差异。

表4 婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇含量Table 4 Inositol contents in infant formula and milk mg/100 g

图2 婴幼儿配方乳粉样品（A）和牛乳（B）中肌醇色谱图Fig. 2 Chromatograms of inositol in infant formula (A) and milk (B)

3 结 论

本实验采用离子色谱串联三重四极杆质谱法测定婴幼儿配方乳粉和牛乳中的肌醇含量。通过优化样品前处理方法、淋洗液成分、质谱参数，选择合适的分离色谱柱和母离子与子离子的离子对，建立一种测定婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇含量的方法。该方法能够获得较好的分离效果、回归线性和高灵敏度，检出限和定量限均低于国家标准，且方法简单快捷，能实现快速检测，完全适用于婴幼儿配方乳粉和牛乳中肌醇的测定。