光强与源叶激素协同调控幼龄胡椒成穗的研究

祖超，李蓉蓉，李志刚，王灿，鱼欢，郑维全，杨建峰

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所， 海南 万宁 571533； 2.农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室， 海南 万宁 571533；3.海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室， 海南 万宁 571533)

香辛料之王胡椒，种子繁殖非生产期较长，生产中一般采用扦插繁殖，插条苗培育1个月后即可开花结果，导致胡椒整个生命周期都在开花结果。严格来说胡椒营养生长与生殖生长时期界限不明显，造成了胡椒生殖生长和营养生长争夺养分，在非主花期抽穗开花浪费树体养分。不仅胡椒，咖啡、龙眼、芒果等热带植物都存在周年开花结果现象，因此，探明调控胡椒花穗抽生脱落的关键生理过程，减少非主花期花量，增加主花期花量，对胡椒产业乃至整个热作产业产量生理学过程的研究具有重要意义。胡椒原产于印度西高止山脉热带雨林区，是多年生常绿耐荫藤本植物[1]，根据耐荫特性，以及光合产物和植物激素是调控花量的重要内部信号[2-3]，前人研究多集中于改变光强调控叶片光合产物和激素含量，进而增加或降低胡椒花穗数目，研究发现改变胡椒生长环境的光强，可以通过调控光合产物含量进而影响胡椒花穗数目[4]、产量和品质[1]，通过间作遮荫可以提升叶片光合作用能力，这对产量的贡献率达52%[5]；光强还可以改变叶片内源赤霉素含量影响胡椒花穗数目[6]，除了赤霉素，脱落酸也会影响植物成花，重度遮荫也可以降低ABA/IAA和ABA/GA3不利于郁金香成花[7]。前期研究主要集中于光强可以改变叶片光合产物含量和激素含量调控胡椒花穗数目和产量，但是，光强过高或过低时，胡椒源叶应答光胁迫的关键光合作用参数和激素指标尚不清楚。本研究在已有研究基础上进一步探明光强调控源叶光合作用和激素含量对胡椒花穗抽生、脱落、成穗影响的关键生理过程，这对补充热带作物产量生理学过程研究，以及在生产中采用植物生长调节剂调控花量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试材一：以在沙床培养1个月，长势一致的胡椒插条苗为试材。

试材二：以中国热带农业科学院香料饮料研究所的胡椒试验示范基地 (18°1′N，110°13′E)内的2龄热引1号(PipernigrumL.cv.Reyin No.1)幼龄胡椒为试材。其中叶片形态、光合生理、碳代谢相关参数选取花所在叶位下一叶位的完全稳定叶，即倒二叶为试材[1]。该区域年均温24.6 ℃左右，日照时数1 804～2 300 h，年均降水量约2 164 mm。

1.2 方法

1.2.1 室内光强模拟试验方法 试验选用福建九圃生物科技有限公司提供的智能补光系统(JIUPO-1WSLED-210)，设置405 μmol·m-2·s-1和270 μmol·m-2·s-12个试验处理，8个生物学重复，光照时间为12 h/12 h，昼夜温度为28 ℃，插条苗采用石英砂栽培，浇灌营养液的方法，营养液组成(μmol·L-1)：75 K2SO4、65 MgSO4·7H2O、10 KCl、25 KH2PO4、1 MnSO4·H2O、1 ZnSO4·7H2O、1 CuSO4·5H2O、5(NH4)6MO7O24·4H2O、1 H3BO3、100 FeSO4·7H2O、100 Na2-EDTA、2 000 Ca(NO3)2·4H2O，培养时间为70 d。

1.2.2 田间原位遮荫试验方法 此研究在2017年8月—2019年7月进行，试验于8月上旬开始，设置全光照和遮荫2个处理，主花期(9—11月)，全光照处理日均光合有效辐射(9:00—16:30)为322 μmol·m-2·s-1，日均最大光合有效辐射为1 110 μmol· m-2·s-1，遮荫处理选用遮阳网遮荫，日均光合有效辐射为137 μmol· m-2·s-1，日均最大光合有效辐射为335 μmol·m-2·s-1。每个处理选取 3 株长势基本一致的植株，每株作为1个重复。种植园胡椒株行距为 2 m×2.5 m，植株高约1.5 m，冠幅约1.4 m，东西走向。

1.2.3 花穗数目测定 田间原位试验，每个处理选取3株长势一致的胡椒，在主花期统计花穗数目，在果熟期统计果穗数目，差值即为脱落数，室内采用挂牌方法统计花穗抽生、脱落数目。

1.2.4 光合参数测定 在花穗抽生长至稳定后用LI6400型便携式光合仪(LI-6400,LI-COR,Lincoln,NE,USA)测定胡椒花穗所在叶位下一叶位完全展开叶 9:00—11:30 时的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)。

1.2.5 胡椒源叶激素含量测定 本试验采用高效液相色谱法(HPLC)测定生长素(IAA)、赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)。3种激素的提取方法：称取约0.1 g新鲜植物叶片，放入研钵中磨碎，加入1 mL预冷的甲醇，4 ℃浸取过夜。8 000 g离心10 min，残渣用0.5 mL 60%甲醇浸取2 h，离心后取上清液，合并2次上清液，40 ℃氮气吹干至不含有机相，加入0.5 mL 10%石油醚萃取脱色3次，弃去上层醚相，下层40 ℃氮气吹干，加入25%乙酸乙酯定容至0.5 mL，取适量溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内待测[8]。色谱检测步骤及条件：开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱温35 ℃，保留时间60 min，检测波长254 nm，设置完毕保存方法组；用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。

1.2.6 数据统计分析 文中每个数据点来自3个重复的平均值，采用SPSS Statistic 25.0软件进行t检验。通过数据分析检测不同光强处理对胡椒叶片光合作用、激素含量和花穗数目的影响是否存在显著差异。采用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 光强对胡椒源叶光合作用的影响

室内光强模拟试验研究光强对胡椒源叶光合作用的影响。发现在花穗稳定后测量叶片光合作用，发现270 μmol·m-2·s-1光强处理下，光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)都显著高于405 μmol·m-2·s-1，分别比405 μmol·m-2·s-1处理增加了60%、100%和54%。田间原位遮荫试验研究发现，遮荫处理处理下，胡椒源叶光合参数都高于全光照处理，但是均不显著。室内和田间原位试验都发现降低光强的处理反而会提升胡椒叶片光合作用(表1)。

表1 光强对胡椒源叶光合作用的影响

2.2 光强对胡椒源叶激素含量的影响

2.2.1 室内光强模拟对胡椒源叶激素含量影响 通过室内光强模拟试验研究光强对胡椒稳定叶片内源激素含量的影响，发现低光强270 μmol·m-2·s-1处理相对于光强高405 μmol·m-2·s-1处理，提升了源叶生长素(IAA)和脱落酸(ABA)含量，降低了赤霉素(GA3)含量，其中对GA3含量影响较大，但是差异都不显著。而后又分析了源叶赤霉素与脱落酸相对含量(GA3/ABA)，发现低光强270 μmol·m-2·s-1处理相对于光强高405 μmol·m-2·s-1处理显著降低了该比值20%；分析源叶生长素与脱落酸相对含量(IAA/ABA)，发现两种光强处理对该比值没有显著影响(表2)。

2.2.2 田间原位遮荫对胡椒源叶激素含量影响 通过田间原位遮荫试验，研究光强对胡椒花穗发育不同阶段相应源叶激素含量的影响，发现光强改变可以调控源叶激素含量，低光照可以降低源叶IAA含量，其中，在花穗发育到8 cm时，源叶IAA含量显著降低53%(图1-A)；随着花穗的增长，源叶GA3含量是不断增加的，遮荫处理相对于全光照处理增加较多，但是差异不显著(图1-B)，光强改变对花穗发育到2 mm和4 cm时相应叶片的ABA含量没有显著影响，遮荫处理显著降低了8 cm花穗相应叶片ABA含量13%(图1-C)。随着花穗从2 mm长至8 cm，源叶GA3/ABA的值是不断增加的，遮荫和全光照无显著差异，在4 cm和8 cm阶段稍高于全光照(图1-D)。花穗发育不同阶段，遮荫处理下源叶IAA/ABA的值都低于全光照处理，其中花穗长至8 cm时差异达显著含量，遮荫处理比全光照低56%(图1-E)。

2.3 光强对胡椒花穗数目的影响

室内光强模拟试验研究发现光强改变对胡椒抽穗数没有显著影响，但是会影响胡椒花穗脱落数，较低光强处理270 μmol·m-2·s-1相对于较高光强405 μmol·m-2·s-1处理显著增加了花穗脱落数，最终导致成穗数目显著降低了59%(图2-A)；田间原位遮荫试验研究发现遮荫会显著降低胡椒抽穗数目，相对于全光照降低了40%，遮荫增加了胡椒花穗脱落数，但是不显著，最终胡椒成穗数目显著降低36%(图2-B)。

表2 室内光强模拟对胡椒源叶赤霉素含量的影响

注：柱状图上方“(+)”代表不同处理间差异显著(P=0.05)，n.s.代表不同处理间无显著差异。下同。

3 结论与讨论

光强过高导致胡椒光合速率降低[9]，光强过低导致胡椒花量减少[10]，而且不适宜光强还会导致胡椒生理过程紊乱[11]，因此，探明胡椒对不适宜光强做出的适应性反应，对调控胡椒生理过程，进而增加胡椒花量、提高产量具有重要意义。本文采用研究不同光强对胡椒源叶光合作用和激素含量的影响，探明了响应光强胁迫、调控胡椒成穗的关键源叶光合作用参数和激素指标。

室内光强模拟试验和田间原位遮荫试验的研究结果，都表明高光强会降低叶片光合作用能力，光合速率、气孔导度和蒸腾速率在较高光强条件下降低，其中室内光强模拟试验处理间差异显著。这些参数中，气孔导度降低最多，可能是胡椒响应光胁迫的关键光合作用参数。气孔导度的改变可能是植物遇到胁迫时的一种反应，ABA信号途径在植物胁迫应答中起核心作用[12]，增加植物体内ABA含量会导致叶片气孔导度降低[13]。本研究测定了植物叶片内源ABA含量，发现田间遮荫试验，较高光强处理下胡椒花穗发育至8 cm时，相应稳定叶片ABA含量相对于低光强处理显著增加，可能与田间原位试验有高光强胁迫相关。田间全光照处理光合有效辐射值在中午较大，最终可以达到1 110 μmol·m-2·s-1，超过了胡椒的光饱和范围450 ～900 μmol·m-2·s-1[1]，导致胡椒通过增加源叶ABA含量应答高光强胁迫，ABA与受体结合，抑制PP2C磷酸酶活性[14]，进而使SnRK2s 从PP2C-SnRK2的复合物中释放出来，激活的SnRK2s 能够磷酸化并激活下游的ABF等转录因子，这些转录因子能够调控下游的ABA应答基因，从而激活ABA信号[15-17]，降低气孔导度。田间原位试验发现的光强增加导致叶片气孔导度降低、ABA含量增加，这种抗逆反应可能是促使胡椒成穗增加的关键因素之一。从田间试验光强对花穗数目的调控来看，光强调控的主要是花穗的抽生数目，但是，田间原位试验中，全光照处理下，胡椒2 mm花穗对应叶片中ABA没有显著增加，一方面可能是ABA向库器官转运了，另一方面可能是GA3的拮抗作用导致的[12]。

图2 光强对胡椒花穗数目的影响

光强和激素信号途径存在交叉互作影响[18-19]，GA3是光合作用的调节剂[3]，IAA对光合作用有促进作用，所以本文又研究了内源IAA和GA3对光强的响应。室内光强模拟试验研究发现不同光强对源叶IAA和GA3含量没有显著影响，田间原位试验研究发现花穗发育不同阶段全光照处理源叶IAA含量要高于遮荫处理，其中8 cm花穗对应叶片IAA含量差异达显著含量，叶片GA3含量，随着花穗发育，2种光强处理下源叶GA3含量都是不断增加的，其中遮荫处理增加较多，但是与全光照无显著差异。那么，室内光强模拟试验2种光强处理下抽穗数无显著差异，但是，较低光强处理会导致花穗脱落显著增加，最终成穗数较低光强显著小于较高光强；田间原位试验2种光强处理下抽穗数达显著含量，脱落数无显著差异，较低光强抽穗数减少是导致成穗减少的关键。源叶激素含量在花穗抽生和脱落中起到一定作用，本研究发现室内光强模拟试验，较低光强处理显著降低了成熟源叶的GA3/ABA，这可能是导致其花穗脱落的关键因子，因为GA3含量的提升有利于胡椒花穗数目增加[6]，这与拟南芥的研究结果相似[20]，但是与郁金香[7]、芒果[21]和百合[22]研究结果不同，这可能是因为胡椒为短日照植物，在短日照植物中，因为缺乏光周期开花途径的调控，赤霉素途径扮演了重要的角色，成为了必须的调控途径[23]。田间原位试验发现，遮荫会减少胡椒抽穗数目，从本研究结果看，这与激素含量相关性较小，尽管遮荫降低了IAA/ABA，但是降低效果不显著；遮荫没有增加胡椒花穗脱落数，推测是因为遮荫条件下胡椒GA3/ABA没有显著降低，所以，适度提高GA3/ABA比值是保证花穗不脱落的关键因素。

综上所述，光强改变可以通过影响胡椒光合作用和激素含量调控胡椒花穗数目。本研究发现光强调控激素含量影响胡椒成穗的原因有2方面：首先，在光强不适宜条件下，如果光强可以诱导胡椒叶片ABA含量增加、气孔导度降低，就可能会导致成穗数目增加；其次，在光强不适宜条件下，GA3/ABA比值过低就会导致胡椒花穗脱落。所以，生产中应确保稳定叶片中GA3/ABA比值在1.5～2.0范围内，在主花期选择适宜的光强或喷施GA3和ABA等生物刺激素，可以提升叶片光合作用，增加成穗数目；非主花期采用遮荫或喷施刺激素的技术手段降低叶片GA3/ABA比值，使花穗脱落，可以减少树体养分损失，节约人工摘花成本。