猪细小病毒分子生物学检测方法的研究进展

余同江 陈 坚

（广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州 511356）

猪细小病毒病是由猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）引起猪的繁殖障碍疾病，主要引起母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔等，亦可引起仔猪皮炎、腹泻及呼吸系统疾病，在断奶仔猪多系统衰竭综合征中也起重要作用[1]。该病广泛分布于世界各地，并在大多数猪场呈地方性流行，严重影响养猪业的发展。随着分子生物学技术的不断发展，常规PCR、实时荧光定量PCR、核酸探针、LAMP、RPA和基因芯片等检测方法都已应用到猪细小病毒的检测中，但在实际临床应用中，由于各地的实验条件存在差异，因此有必要挑选适合的方法进行检测。

1 常规PCR方法

常规PCR（聚合酶链反应）是一种DNA体外扩增技术，通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以实现快速诊断，是目前临床应用较广泛的检测方法。邹敏等[2]参考VP2基因建立了PPV的PCR检测方法，符合性结果显示：该PCR方法优于HA、VI以及IHA。使用该方法对215份病料进行了检测，检出阳性样品25份，检出率为 11.63%。Li等[3]通过序列分析、引物设计和参数优化，建立了CSFV、JEV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重PCR检测方法，最低可检测浓度为10-3ng/μl，具有很高的特异性，临床检测结果与单次PCR结果一致。

2 实时荧光定量PCR方法

荧光定量 PCR 方法可分为荧光染料和荧光探针，具有操作简便、敏感性高、快速高效等优点，完全闭管操作污染小，可实时监测分析数据，结果更为准确、直观。陈坚等[4]建立了PPV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。结果表明，该方法具有良好的特异性，检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2和SIV均为阴性；其最低检出量为7 copies/μl，且批内和批间重复性良好。用该方法与常规PCR、LAMP方法对临床病料进行检测对比，显示该方法灵敏度高、成本低。Song等[5]建立了一种基于TaqMan探针的PPV实时定量PCR检测方法，其检出限为1×10²copies/μl，与PCV2、PRRSV、PRV、CSFV和JEV无交叉反应。该方法具有特异性和重现性。在41例临床标本中，用该方法检测到32例PPV，而用常规PCR方法检测到11例PPV。

3 核酸探针方法

核酸探针方法是利用碱基互补原理检测目的核酸片段，具有敏感性高、特异性强的特点，不仅是研究核酸结构和功能的重要手段，还可进行传染病的早期诊断。Krell P J等[6]率先用32P标记的探针检测细胞培养物中的PPV，最低可检出 0.1pg 的DNA，其敏感度是HA的100倍。白红光等[7]利用地高辛标记制备了两种PPV核酸探针检测方法，特异性试验结果表明，这两种探针都能与PPV DNA发生特异的阳性杂交，而与对照的PRV、PCV、PRRSV和HCV的核酸杂交呈阴性。敏感性试验结果表明，克隆NS1探针敏感度为0.5 pg /μl，NS1基因PCR产物探针敏感度为1 pg/μl。

4 LAMP方法

LAMP（环介导等温扩增）方法是日本学者NOTOMI等发明的一种体外等温扩增特异核酸片段的技术。在等温条件下，基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率和特异性高，该方法用时短，对设备要求低。ZHAO等[8]建立了可视化环介导等温扩增（LAMP）检测PPV感染的方法。扩增产物用SYBR GreenⅠ染料染色后目测和常规琼脂糖凝胶电泳分析，两种方法的灵敏度相同。LAMP法检测PPV的检出限为10 copies，比常规PCR方法低100倍。该检测方法与其他病毒不发生交叉反应，对1100个现场样本进行检测，检测到660个阳性。胡瑞丽[9]建立了检测PPV的LAMP方法并研制了试剂盒，用该检测试剂盒对临床样品进行PPV的检测限为10 copies/μl，而常规PCR检测法的检测限为1000 copies/μl，该方法不会与PCV2、PRRSV、PRV和CSFV发生交叉反应。用该检测试剂盒对1100个临床样品进行检测，320个样品为阳性。

5 重组酶聚合酶（RPA）方法

重组酶聚合酶（RPA）方法是由PIEPENBURG等研发的一种由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术，具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点。该方法可通过与试纸条、探针或凝胶电泳等相结合的方式，实现扩增产物的定量分析或可视化判别。刘立兵等[10]建立了38℃恒温水浴锅检测PPV的RPA方法，在恒温反应30min，能够特异性的检测PPV；以重组质粒pPPV-VP2作为模板，RPA的检测限为102拷贝，同研究中应用的实时荧光定量PCR方法检测限一致，比普通PCR方法高100倍；该方法对疑似PPV感染临床样品的阳性检出率为82.6%，略低于实时荧光定量PCR（86.9%），明显高于普通PCR（66.7%）。WANG等[11]建立了检测PPV的实时RPA方法，在39℃下反应20 min，与其它病原无交叉，最低可检测103拷贝的重组质粒。用该方法与实时PCR方法平行检测115份样品，两种检测方法的符合率为100%。

6 基因芯片方法

基因芯片又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列，是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。将分子生物学技术、计算机技术以及标记融于一体，可对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析，具有快速、高特异性、高灵敏性、高通量、多样性等特点。吴凤笋等[12]以VP2基因为目的基因设计引物和探针建立了PPV的基因芯片检测方法，根据荧光信号的强度来确定是否存在PPV，检测灵敏度可达34.5 ng/μl；同时用制备的基因芯片对临床20份疑似PPV感染的病料进行检测，检测结果与PCR检测结果符合率达100%。刘胜利[13]基于PCV2、PRRSV、PPV、JEV和CSFV的保守区域设计引物与探针，将探针喷点固化于醛基化基片上并进行后期处理，制备出寡核苷酸芯片。同时确立了最佳杂交反应条件为55℃杂交箱杂交2h，且探针浓度在1μM时即可得到较好的杂交信号。敏感性试验结果表明该诊断方法达到了10-5ng级，临床试验结果与多重PCR检测结果符合率达100%。

7 结语

在非洲猪瘟新常态下，更加需要严格做好猪场PPV的检测和防控。虽然目前多种分子生物学检测方法已应用于PPV的临床检测，但不同的检测方法也存在一定的局限性，有时需将几种检测方法结合起来，综合判断，才能得到准确的检测结果。相信随着科学技术水平的不断发展，更快速、准确、简便的方法会在临床检测中发挥更重要的作用。