何远芬,闵香玉,谢婷婷,杨信容,赵勇
遵义医科大学附属医院,贵州遵义563000
特发性肺纤维化(IPF)是一种原因不明的,以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病,患者预后极差。目前,针对IPF的治疗药物较少,仅有的抗纤维化药物还存在治疗效果有限且不能延长患者寿命的缺点[1-3]。肺移植是唯一可延长IPF患者预期寿命的治疗手段,但存在供体肺稀缺、术后并发症多等不足[4]。因此,寻找安全有效且经济实惠的治疗药物对IPF至关重要。磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)是一种重要的能量代谢激酶,能够调控机体的能量代谢。有研究发现,IPF患者体内AMPK表达下调。因此,上调AMPK表达可能对IPF治疗具有积极作用。二甲双胍是国内外各大糖尿病指南推荐的2型糖尿病首选治疗药物,不仅能降低血糖,还能预防和减少糖尿病并发症[5]。已有研究证实,二甲双胍的降糖作用与AMPK信号途径激活有关[6]。MANNING等[7]研究报道,在肺纤维化小鼠模型中,二甲双胍可通过激活AMPK降低多种促纤维化蛋白表达,从而逆转肺纤维化。二甲双胍可能是目前发现的,唯一能够逆转肺纤维化的药物。但由于目前还没有动物模型能够完全拟合人类IPF的病理变化,二甲双胍在IPF临床治疗中的应用仍任重而道远。本文结合文献就二甲双胍激活AMPK抑制IPF的研究进展作一综述。
IPF是一种原因不明的慢性进行性纤维化性间质性肺炎,临床特征是呼吸困难和肺功能逐渐恶化。IPF通常发生于中老年人,每年发病率为4/10万~11/10万,全世界已超过500万例,其中位生存期仅3~5年[1-3]。糖皮质激素、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸可用于治疗IPF,但并不能增加患者预期寿命,5年生存率仍低于50%。除此之外,长期使用皮质类固醇或类固醇激素还可引起多种不良反应,导致IPF患者病死率升高。尼达尼布和吡非尼酮虽然能阻止肺纤维化进程,但其价格昂贵、不良反应多且不能逆转已经发生的肺纤维化。迄今为止,关于IPF的研究并不少见,但其确切病因和发病机制仍不完全清楚。持续性严重感染、放化疗、环境暴露或不明原因所致的肺泡上皮细胞损伤,刺激各种免疫细胞浸润肺组织并促进炎症反应发生,引起上皮间质转化(EMT)和多种纤维化相关因子分泌增加,肺成纤维细胞和肌成纤维细胞过度增殖并异常分化,表现为细胞外基质(ECM)蛋白过度沉积、代谢紊乱、线粒体功能障碍、自噬异常,继而肺组织重塑和纤维化瘢痕形成并代替正常肺泡组织,肺功能呈进行性下降,最终因呼吸衰竭而死亡[3,8-9]。
AMPK是由α、β、γ三种亚基组成的异源三聚体蛋白复合物,存在于所有真核细胞中。AMPK作为公认的细胞内能量感受器和代谢调节剂,不仅可控制合成代谢向分解代谢转化,还能参与调控细胞的多种生物学过程,如自噬调节、内质网应激、氧化应激等。AMPK能够刺激糖酵解、脂肪酸β氧化等能量生产途径,抑制脂肪酸生物合成、胆固醇生物合成和糖异生等能量利用途径。除此之外,AMPK激活还具有抗组织重塑功能。AMPK活性降低与肝、肺、肾等组织纤维化密切相关[3,10]。AMPK可在缺氧、葡萄糖缺乏等特定条件下被激活,其活性与细胞内AMP水平呈正相关关系。二甲双胍是国内外各大糖尿病指南推荐的2型糖尿病首选治疗药物,能够通过抑制呼吸电子传递链复合物Ⅰ,从而抑制线粒体氧化磷酸化,减少ATP生成并增加细胞质内AMP和ADP,进而提高AMP/ATP间接激活AMPK。二甲双胍在IPF中的保护作用已有报道,其机制可能是通过激活AMPK实现的。目前认为,二甲双胍激活AMPK可能通过以下途径抑制IPF进展:阻断核因子κB(NF-κB)通路,抑制炎症反应;下调转化生长因子β(TGF-β)表达,抑制肺纤维化;抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达,激活自噬[11-13]。
2.1 阻断NF-κB通路,抑制炎症反应 NF-κB是炎症反应的主要转录因子,在免疫应答中起重要作用。NF-κB由Rel(c-Rel)、p65(RelA)、RelB、p50、p52五个亚基组成,其中p65是其主要亚基。二甲双胍能够阻断NF-κB通路,抑制下游炎症因子IL-1、IL-6、IL-8表达。二甲双胍通过激活AMPK抑制IκB激酶活性,抑制细胞因子诱导的NF-κB核易位,从而减弱了IκBα的磷酸化,抑制了IκBα降解。AMPK激活后,通过其下游介质沉默交配型信息调控2同源物1、叉头盒蛋白O家族、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α和p53,间接抑制NF-κB信号传导,从而抑制炎症因子表达[13]。此外,内源性分子或微生物激活NF-κB可增加NLRP3炎症小体表达。NLRP3炎症小体是一种由NOD样受体蛋白3、连接蛋白ASC和半胱天冬氨酸酶原1前体组成的多蛋白复合物。激活NLRP3炎症小体可导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1成熟及IL-1β、IL-8加工[14]。简悦[15]研究表明,二甲双胍能够通过调节AMPK/NF-κB炎症通路,改善肺纤维化大鼠肺部炎症,对肺纤维化具有抑制作用。NF-κB在肺纤维化疾病的炎症反应中具有重要作用,能够引起一系列炎症反应。而AMPK激活剂二甲双胍可通过上调AMPK活性,抑制NF-κB表达,从而抑制炎症因子释放,在肺纤维化疾病的炎症反应中发挥抑制作用。
2.2 下调TGF-β表达,抑制肺纤维化 TGF-β是已知最主要的促纤维化生成因子,在细胞或组织中广泛表达。TGF-β与潜在的TGF-β结合蛋白形成复合体,以复合体形式被释放出来,从而发挥一系列生物学功能。在IPF发生、发展过程中,TGF-β起着至关重要的作用。TGF-β能够通过抑制上皮细胞增殖、促进肺泡上皮细胞异常修复和结构重塑介导肺纤维化[16]。TGF-β与靶细胞膜上的受体结合,以Smad依赖性和非依赖性方式调节靶基因转录,从而在炎症细胞的活化、EMT和ECM生成等过程中发挥重要作用。在Smad家族中,Smad3充当致病性介质,而Smad2和Smad7作为保护性介质。TGF-β诱导的Ⅰ型胶原蛋白产生并伴随着Smad3激活,诱导Smad3易位至细胞核,其作为转录激活因子上调上皮细胞中下游靶因子结缔组织生长因子(CTGF)表达,进一步诱导Ⅰ型胶原蛋白生成。Smad3敲低则可抑制TGF-β对Smad3磷酸化和Ⅰ型胶原蛋白生成,降低CTGF表达[17]。在IPF动物模型和IPF患者肺组织中均发现TGF-β表达上调。肺泡上皮细胞受损时,活性氧簇分泌增多,基质金属蛋白酶表达下调,Ⅳ型胶原蛋白降解,肺泡上皮细胞凋亡并阻碍正常上皮再生,活化的T细胞和巨噬细胞进入成纤维细胞,产生TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子,诱导EMT,促进成纤维细胞向成肌纤维细胞分化,导致包括纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原蛋白在内的ECM蛋白过度沉积,这一系列事件是由TGF-β通过经典的Smad2/3途径或非经典的丝裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3激酶途径引起的[11]。在博来霉素诱导的肺纤维化模型(BIPF)大鼠中,纤维化相关因子表达增加,二甲双胍可通过抑制TGF-β1信号转导,抑制肺泡EMT,上调肺组织上皮型标志物钙黏蛋白、紧密连接蛋白1表达,下调α平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、胶原蛋白表达和Smad2/3磷酸化水平[18]。AMPK激活可通过TGF-β抑制肌成纤维细胞增殖、分化,促进成纤维细胞死亡[3]。二甲双胍激活AMPK通过抑制Smad3驱动的CTGF表达,降低TGF-β诱导的Ⅰ型胶原蛋白生成。TGF-β还可通过经典的Smad通路和非经典的Smad通路参与肺泡上皮细胞异常增殖和肺组织结构重塑,这也与AMPK活性受到抑制有关。二甲双胍作为AMPK的激活剂可能通过上调AMPK活性,下调TGF-β表达,从而产生抗肺纤维化作用。
2.3 抑制mTOR表达,激活自噬 AMPK活性丧失会通过自噬不足、ECM累积和线粒体功能障碍,促进成纤维细胞持续活化[3]。AMPK/mTOR是主要的自噬通路,AMPK激活可通过直接磷酸化ULK1促进自噬,也可通过抑制mTOR激活自噬。自噬开始于吞噬体的分离膜吞噬细胞组分,受ULK1复合物、Beclin1复合物的激活控制;接着是吞噬体膜的延伸和融合形成自噬体,需要ATG5、ATG12和微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)结合蛋白SQSTM1,并与自噬体内膜上的LC3-Ⅱ蛋白结合;随后自噬体与溶酶体融合,形成自噬溶酶体。Beclin1、ATG12、LC3-Ⅱ、p62等均被认为是自噬发生的生物标志物。Beclin1是自噬启动的标志性蛋白。ATG基因通过ATG12-ATG5和LC3-Ⅱ复合体控制自噬体形成。LC3与自噬小泡的数量呈正比,是自噬小体的标志性分子。自噬受体蛋白p62是自噬后期的降解产物,与自噬活性呈负相关关系。磷酸化AMPK的主要上游激酶是肝激酶B1(LKB1),下游底物蛋白是mTOR。LKB1可以编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,直接激活AMPK。二甲双胍通过使LKB1蛋白表达和启动子活性增加,以时间和剂量依赖方式刺激AMPK磷酸化而激活自噬,上调LC3-Ⅱ表达。3-甲基腺嘌呤和氯喹通过抑制自噬通路或下调Beclin1和LC3-Ⅱ,阻断二甲双胍的自噬保护作用[19-23]。在肺纤维化过程中,AMPK活性降低可激活mTOR表达,使自噬水平受到抑制,随之发生纤维化病变。二甲双胍通过激活AMPK/mTOR通路上调自噬水平而发挥抗肺纤维化作用。
3.1 二甲双胍在BIPF中的作用 BIPF是最经典的肺纤维化模型,被广泛用于肺纤维化研究。在BIPF中,肺组织呈现明显的纤维化病理改变,早期表现为肺部炎症改变,晚期表现为肺部纤维化改变。有研究报道,二甲双胍干预能够降低BIPF小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)总细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞计数,血清炎症因子(如TNF-α、IL-6)水平降低,肺组织匀浆纤维化标志物(如TGF-β、Smad2/3、Ⅰ型胶原蛋白等)表达亦降低[7,12,24]。GAMAD等[24]用不同剂量二甲双胍干预BIPF小鼠,发现二甲双胍能够明显改变肺纤维化病理改变,并具有剂量依赖性;进一步研究证实,二甲双胍通过上调AMPK表达和活性,抑制TGF-β表达,从而发挥抗肺纤维化作用。结果表明二甲双胍能够降低BIPF小鼠肺部炎症反应和纤维化程度[12,24]。
3.2 二甲双胍在吉非替尼诱导肺纤维化中的作用 吉非替尼是一种治疗肺癌的表皮生长因子受体—酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI),其副作用之一是可导致肺部炎症反应和纤维化。LI等[25]在雄性SD大鼠气管内注射博来霉素可导致正常肺结构破坏,成纤维细胞和炎症细胞增多,胶原纤维广泛沉积;口服吉非替尼可显著增强其肺纤维化程度;羟脯氨酸(HYP)是肺纤维化中胶原纤维的主要成分之一,二甲双胍干预后可使肺组织HYP表达降低。二甲双胍能够显著降低EGFR-TKI治疗后肺癌细胞中TGF-β表达,其下游分子IL-6、pSmad2和pSmad3表达降低,减少了肺泡区EMT发生。以上研究表明,二甲双胍能够用于治疗吉非替尼诱导的肺纤维化,或许今后可以与抗肿瘤药物一起服用,来预防吉非替尼副作用引起的肺纤维化。
3.3 二甲双胍在辐射诱导肺纤维化中的作用 放疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一,但辐射过量可诱导肺纤维化。WANG等[26]研究发现,SD大鼠接受全肺20 Gy照射后肺密度值明显升高,而二甲双胍干预后能明显降低胸部照射引起的肺密度值升高,说明二甲双胍能够降低肺实质组织病理学改变,局灶性纤维化结节、炎症浸润和胶原沉积明显改善;二甲双胍治疗后肺组织HYP、Col1、TGF-β表达降低,还观察到二甲双胍干预能够抑制辐射诱导的pSmad2、pSmad3表达。以上研究表明,二甲双胍能够抑制辐射诱导的肺纤维化,其机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路,从而减弱辐射诱导的肺成纤维细胞活化有关。因此,二甲双胍可能适用于放疗引起肺纤维化的预防和治疗。
当前,对IPF仍缺乏有效的治疗手段,二甲双胍作为治疗2型糖尿病的首选药物,能够通过激活AMPK作用于下游靶标NF-κB、TGF-β、mTOR,从而通过抑制炎症反应、肺纤维化和激活自噬发挥肺保护作用。二甲双胍对IPF动物模型具有较好的肺保护作用,但对IPF患者并未明显改善疾病进展和临床预后[27],这可能与评价标准不一、观察时间不足以及服用可能影响结局的干预药物等有关。二甲双胍虽然有望成为未来治疗IPF相对理想的药物,但目前仍需要相关的临床研究进一步探索。