利妥昔单抗治疗局灶节段性肾小球硬化症机制的研究进展

季垠宏，任 红

上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏内科，上海 200025

局灶节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）是一种常见的肾小球肾炎类型。研究[1]发现，全球FSGS 的年发病率为（0.2 ～1.8） /10 万；同时，美国的一项为期12 年的研究显示，FSGS 为肾活检最常见的一种病理类型（占比约39%）。根据改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）指南，目前对于FSGS 的一线治疗方案主要包括血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（angiotension Ⅱ receptor blocker，ARB）、激素、免疫抑制剂等[2]。然而，对于激素依赖性肾病综合征（steroid-dependent nephrotic syndrome，SDNS）患者来说，无论是长期使用单纯激素治疗抑或激素联合免疫抑制剂治疗，患者均会产生较大的不良反应，且对于激素抵抗性肾病综合征（steroidresistance nephrotic syndrome，SRNS）患者来说，不仅单纯激素疗效不佳，部分患者在加用免疫抑制剂后仍然得不到临床缓解。因此，探寻FSGS 的新型治疗方案成为了国内外研究的热点之一。自2005 年Nozu 等[3]应用利妥昔单抗（rituximab，RTX）进行儿童移植肾后复发肾病综合征的治疗后，针对RTX 的研究遂逐渐展开。

RTX 是一种作用于B 细胞表位CD20 的人鼠嵌合单抗，目前已获得美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）的批准，可应用于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎和抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophil cytoplasmic antibody， ANCA）相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）的临床治疗。作为一种初始用于血液病和自身免疫性疾病的治疗药物，RTX 用于治疗肾脏病的时间较短且应用剂量及疗程也尚未形成共识。既往临床试验[4-5]表明，RTX 治疗FSGS 可降低患者的尿蛋白水平，从而延缓疾病进展，保护肾脏功能。目前，针对RTX 的临床研究主要见于病例报告以及单中心、小样本的回顾性研究，尚缺乏大样本、多中心的随机对照试验分析；同时，对于RTX 治疗FSGS的具体机制尚不明确，有关这一问题的研究可以归纳为下列几方面。

1 RTX 直接作用于B 细胞发挥疗效

RTX 直接作用于B 细胞表位CD20，通过细胞凋亡、补体依赖的细胞毒性作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）和抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）共3 种经典的调控体液免疫的途径减少B 细胞的数量，调节自身免疫[6-10]。其中，体外实验[6-7]已证实RTX 可以通过CDC 直接消耗B 细胞，或通过ADCC 途径间接发挥B细胞毒性作用，而这一过程有多种细胞参与，如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞等。基于长久以来基础免疫学领域的研究，RTX 作为直接作用于B 细胞的单克隆抗体，人们有理由认为其对于FSGS 的治疗作用可能与参与B 细胞介导的体液免疫应答有关。

目前，尚未有明确的指标可以对RTX 在肾病综合征中的疗效及复发预测进行评估。CD19 作为B 细胞共有的表面标志物，其表达水平可直接反映B 细胞的水平。因此，临床上常使用CD19 作为观察RTX 作用效果的指标。有研究[11]使用RTX 治疗难治性肾病综合征患者，结果发现蛋白尿的缓解与B 细胞的数量不构成等比关系；该研究针对4 名SRNS 患儿（其中2 名已通过肾活检被证实为FSGS）进行单剂量RTX 治疗发现，在RTX 治疗后4 名患儿的CD19 水平均低于1%，提示B 细胞已被RTX 完全耗竭；然而在随访中该研究发现，仍有1 名患儿在4 个月时复发，复发时的CD19 水平为0，继而提示CD19 并不能作为观察RTX 作用持续效果的指标。随后，Colucci等[12]探讨了记忆B 细胞和RTX 作用效果的关系，并认为记忆B 细胞的延迟重建对肾病综合征的复发具有预测和保护作用。该研究入组了28 例SDNS/频繁复发性肾病 综合征（frequent relapsing nephrotic syndrome，FRNS）患儿，年龄（13.68±0.77）岁，通过流式细胞术检测SDNS/FRNS 患儿与同龄健康对照患儿的T 细胞和B 细胞亚群的数量，包括CD19+B 细胞（总B 细胞）、过渡B 细胞、成熟B 细胞、记忆B 细胞、IgM 记忆B 细胞、转化记忆B细胞、CD3+T 细胞、CD4+T 细胞和CD8+T 细胞。结果发现，在尚未接受RTX 治疗时，与健康对照患儿比较， SDNS/FRNS 患儿的成熟B 细胞（10% vs 4.5%，P＜0.001）和过渡B 细胞（0.8% vs 0.3%，P＜0.001）的水平均较低， T 细胞水平、总B 细胞水平和记忆B 细胞水平间则无差异；在接受RTX 治疗后的1 个月，28 例患儿的B 细胞亚群均被抑制，6 个月后B 细胞以过渡B 细胞、成熟B 细胞、记忆B 细胞的顺序逐渐恢复至正常水平，并在12 个月达正常水平；随后，对各细胞的亚组进行分析发现，SDNS/FRNS 患儿的过渡B 细胞水平在治疗12 个月时明显高于同龄健康对照患儿（2.2% vs 0.8%），其成熟B 细胞水平虽有所回升但仍低于同龄健康对照组，且其余B 细胞亚群在治疗12 个月时亦显著低于同龄健康对照组。而后，该研究者对上述28 例SDNS/FRNS 患儿进行为期24 个月的随访，其中14 例复发、14 例未复发。采用单因素Cox回归模型对复发/非复发患儿B 细胞亚群进行分析，结果显示随访9 个月时患儿的记忆B 细胞、IgM 记忆B 细胞及转化记忆B 细胞水平以及过去4 个月应用他克莫司的剂量均与复发风险相关；该研究进一步行多因素Cox 回归分析发现，仅转化记忆B 细胞水平与复发风险呈显著相关性；行受试者操作特征曲线分析显示，区分复发和非复发患儿的最佳预测值可能为转化记忆B 细胞占总淋巴细胞的比例为0.067%（敏感度71%、特异度93%），或外周血浓度为1.65 个/μL（敏感度64%、特异度86%），即在接受RTX 治疗后9 个月时转化记忆B 细胞/总淋巴细胞＜ 0.067%或转化记忆B 细胞浓度＜1.65 个/μL 的患者，其24 个月内复发的风险显著降低。因此，转化记忆B 细胞或可作为预测复发的潜在指标。

综合上述研究我们发现，关于RTX 的直接作用靶点B 细胞的研究，多数聚焦于基础免疫方面，而对于B 细胞如何参与FSGS 患者肾病综合征蛋白尿缓解的机制并未作深入分析。此外，虽然FSGS 作为肾病综合征常见的病理类型且临床应用提示FSGS 患者接受RTX 治疗效果尚佳，但目前仍然缺乏更进一步的对于FSGS 及其他肾病综合征病理亚型的分组研究。例如，探讨RTX 是否在肾病综合征不同病理类型之间存在不同的机制，不同的病理类型是否存在不同的检测RTX 作用效果的特异性指 标等。

2 RTX 通过调控T 细胞发挥疗效

如前文所述，在RTX 治疗后、B 细胞水平完全恢复前，转化记忆B 细胞的数量及占比有所增加；此外，RTX虽然对T 细胞总体数量没有影响，但仍然对CD4+/CD8+的比例有所影响。但遗憾的是，该研究并未对此现象进行分析。

在有关RTX 治疗FSGS 的另一项临床试验[13]中，研究者入选激素治疗及钙调磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitors，CNIs）治 疗 均 无 效 的FSGS 患 者22 例，经RTX 治疗后有12 例患者肾病综合征得到缓解，表明该治疗有效。随后，研究者对该12 例患者以及无应答的10 例患者进行T 细胞亚群的流式分析，结果发现与后者相比，前者外周血中CD154+CD4+CD3+细胞[ （78.9%±16.4%）vs（54.9%±28.1%），P=0.03]、IFN-γ+（interferon-γ，γ 干扰素）CD3+细 胞[ （7.5%±6.1%）vs（0.6%±0.8%），P=0.003] 和IL-2+（interleukin 2，白细胞介素2）CD3+[ （4.0%±4.7%）vs（0.2%±0.5%），P＜0.01]水平均有显著下降。继而提示，T 细胞参与了RTX 治疗FSGS 的病理过程。另外，在针对特发性血小板减少性紫癜、系统性紫癜、红斑狼疮、冷球蛋白血症性血管炎患者的既往研究[14]中发现，RTX 参与调节T 细胞亚群。这些研究均从侧面证明了T 细胞在FSGS 的病程进展及RTX 治疗中发挥了一定的作用，然而T 细胞在RTX 治疗FSGS 中的具体参与过程及通路仍有待进一步阐明。目前，关于该机制的研究相对较少，未来或可成为RTX 治疗FSGS 机制探索的另一个方向。

3 RTX 直接作用于足细胞发挥疗效

作为一种靶向B 细胞的药物，RTX 治疗起源于B 细胞的非霍奇金淋巴瘤已在临床上广泛应用。由于RTX 能够在免疫系统中发挥一系列作用，随后其被推广应用于众多自身免疫性疾病，并取得了良好效果。然而，无论是正常人还是FSGS 患者，其足细胞均不表达CD20，且FSGS 亦非经典的自身免疫性疾病，因此有研究推测RTX 在肾脏组织中存在直接治疗靶点。Fornoni 等[15]对此进行研究提示，RTX 在作用于B 细胞及调控T 细胞以外，还能直接作用于足细胞上鞘磷脂磷酸二酯酶样3b 蛋白（sphingomyelin phosphodiesterase acid-like 3b，SMPDL-3b）的表达，调节酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASMase）的活性，从而稳定足细胞的细胞骨架，防止足细胞凋亡。

Fornoni 等[15]首先进行了一个回顾性研究，入组41 例 复发性局灶节段性肾小球硬化症（recurrent FSGS，rFSGS）高危患者（均为肾脏移植患者），其中有27 例在移植后24 h 内接受1 剂RTX 治疗（375 mg/m2）。随后对患者进行随访，3 个月时对照组与治疗组患者的估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）变 化 值 分 别 为（-18.0±16.9）mL/ （min·1.73 m2） 和（-1.3±14.6）mL/ （min·1.73 m2）（P=0.001 2），6 个月时eGFR 变化值分别为（-19.0±19.8）mL/ （min·1.73 m2）和（-5.3±18.4）mL/ （min·1.73 m2）（P=0.007 5）；即与基线相比，在上述2 个时间点中，对照组的eGFR 下降程度均明显大于RTX 治疗组。继而说明，RTX 治疗对肾脏功能具有保护作用。随后，该研究组筛选出一种蛋白，即SMPDL-3b。作为鞘磷脂蛋白，SMPDL-3b 是细胞质膜中脂筏的一部分，可表达在高分化细胞如足细胞上。研究组首先对12 例rFSGS 患者及8 例非rFSGS 患者行肾脏再灌注活检，并对活检标本进行SMPDL-3b 免疫荧光染色，结果发现rFSGS 患者的SMPDL-3b+足细胞数量显著减少。随后，研究组收集rFSGS 患者血清用于培养正常人的足细胞，结果发现经患者血清培养后，正常人足细胞SMPDL-3b 蛋白及mRNA 水平均显著下降，ASMase 活性也显著下降；而施行RTX 治疗则可阻止SMPDL-3b 蛋白及ASMase 活性的下降。进一步行定量共聚焦图像分析发现，rFSGS 患者血清培养的足细胞应力纤维明显断裂，导致肌动蛋白细胞骨架断裂和足细胞凋亡；而RTX 预处理或SMPDL-3b 蛋白的过表达则可阻止这一现象的发生。基于此，研究组构建了SMPDL-3b 敲除细胞系，将其暴露于rFSGS 患者血清后则迅速出现了肌动蛋白纤维的破坏，且RTX 无法发挥之前的保护作用。综合上述结果，研究组认为存在RTX- 维持ASMase 活性- 促进SMPDL-3b 表达- 保护应力纤维- 维持细胞骨架稳定的通路，该通路在rFSGS的病理过程中可阻止足细胞丢失，延缓疾病进程。

RTX 作用于SMPDL-3b 以保护足细胞肌动蛋白、维持足细胞骨架这一通路在之后的实验中亦得到了验证，即在Takahashi 等[16]使用阿霉素诱导肾病大鼠、Tasaki 等[17]使用异种移植肾的狒狒的研究中均得到了与Fornoni 等[15]相同的结果。另外，在Ahmad 等[18]针对足细胞进行辐射干扰的研究中发现，经辐射照射后几种特定的神经酰胺（C16:00、C24:00、C24:1）水平升高，且随时间的变化上述神经酰胺的水平与SMPDL-3b 蛋白呈等比例下降；而高表达SMPDL-3b 的足细胞在辐射后仍具有较高水平的神经酰胺。该研究对肌动蛋白结合蛋白Ezrin 的水平进一步观察发现，于辐射前接受RTX 治疗可维持足细胞SMPDL-3b水平、半胱氨酸蛋白酶3 分裂水平，并稳定足细胞骨架。

有趣的是，除了SMPDL-3b 可以通过维持足细胞骨架稳定参与FSGS 病程，以神经酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）为代表的一些鞘脂类物质作为脂筏的重要组成成分，不仅能够在FSGS 的发生与发展中发挥作用，还能参与其他肾脏疾病的病理过程。研究[19-20]显示，上述物质可在遗传性肾脏病如法布里病，以及非遗传性肾脏病如糖尿病肾病中发生鞘脂积累，并与疾病表现及进展相关。同时在肾脏纤维化的进程中，依然有鞘脂信号通路的参与[21]。脂筏作为细胞组成的重要部分，其结构的不稳定对足细胞具有较大影响。有研究[22]表明，在高糖状态下脂筏中高丰度的蛋白激酶C-α（protein kinase C-α，PKC-α）可介导足细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）泛素化、细胞表面的内吞增强以及细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）激活，从而导致足细胞损伤，引起糖尿病肾病。此外，在对同型半胱氨酸血症损伤足细胞引起肾小球硬化的研究[23-24]中，研究者发现在同型半胱氨酸血症中，含嘧啶结构域3 的核苷酸结合寡聚结构域样受体-3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3，NLRP3）炎症小体可激活足细胞脂筏烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶亚基的聚集，诱导产生、细胞骨架紊乱及细胞凋亡，最终引起足细胞损伤与肾小球硬化。综合上述研究发现，以SMPDL-3b 为代表的脂类对足细胞的作用仍待进一步阐明。

4 RTX 通过渗透循环因子通路间接参与FSGS病理过程

多数研究发现，与肾病综合征的病理机制相关的渗透循环因子主要有可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（soluble urokinase plasminogen activator receptor，suPAR）[25]、心脏营养素样细胞因子-1（cardiotrophin-like cytokine-1，CLC-1）[26]及血管扩张刺激磷蛋白（vasodilatorstimulated phosphoprotein，VASP）[27]等。值得一提的是，在Wei 等[25]于2011 年证实了suPAR 可能会导致FSGS 发生之后，关于suPAR 对FSGS 可能的诱发机制研究一直是该领域的热点。2015 年，Hayek 等[28]针对慢性肾脏病患者开展大规模临床试验发现，suPAR 水平的升高与慢性肾脏病发生、eGFR 水平下降独立相关。2019 年的一项最新研究[29]即通过免疫组织化学法检测对照组、微小病变肾病（minimal change disease，MCD）组和FSGS 组的suPAR 表达水平发现，suPAR 在FSGS 组中的表达较MCD 组与对照组显著增加，且存在80.95%的特异度。同时，有越来越多的研究[30-31]认为可将suPAR 作为FSGS 发生与进展的监测指标。2018 年Alachkar 等[30]在一项临床研究中回顾性纳入血浆置换联合RTX 治疗（12 例）及单纯血浆置换治疗（7 例）的移植后FSGS 患者，并对其suPAR、蛋白尿和肌酐水平以及足细胞β3 整合素活性进行检测；结果显示血浆置换联合RTX 治疗可显著降低患者蛋白尿、suPAR 水平以及β3 整合素活性。然而，该研究并未聚焦suPAR 与RTX 之间的关系，因此研究者既未对该2 组进行均衡设计，也未就2 组之间的差距和关系进行更多 讨论。

一般认为，suPAR 可以通过激活足细胞中αvβ3整合素，导致足细胞骨架重排、足突消失，从而破坏肾小球屏障[32-33]。Fornoni 等[15]对SMPDL-3b 蛋白作用机制的进一步研究发现，SMPDL-3b 可通过RTX- 维持ASMase活性- 促进SMPDL-3b 表达- 保护应力纤维- 维持细胞骨架稳定这一通路维持足细胞稳定，且循环因子也参与其中。该团队在另一项针对糖尿病肾病的研究中进一步发现SMPDL-3b 蛋白可同时与αvβ3整合素相关，即Yoo 等[34]通过免疫共沉淀技术发现，SMPDL-3b 可与suPAR 结合并干扰其与整合素结合激活的下游通路，引起Rho A 因子活性增加，使足细胞更易发生凋亡，从而将suPAR 介导的足细胞损伤从迁移表型转移至凋亡表型。

目前根据一些间接证据可以认为，RTX 能够参与渗透循环因子对FSGS 的致病过程，如通过SMPDL-3b 蛋白与suPAR 结合，改变足细胞凋亡表型，间接保护足细胞等。随着研究的不断深入，有关RTX 是否与循环免疫复合物有直接作用靶点以及在FSGS 进展中如何发挥保护作用，将会被系统研究并揭示。

5 单抗治疗进展

近年来随着对单克隆抗体研究及应用的不断推进，临床上采用该技术治疗FSGS 已取得了阶段性成果。目前，奥法木单抗（ofatumumab）是除RTX 以外的应用于肾脏领域的最有前景的一种单克隆抗体。作为一种人源化靶向CD20 的单克隆抗体，奥法木单抗与RTX 识别的表位不同。在相关病例报告[35-36]中显示，奥法木单抗因其高剂量应用时的不良反应更小，似乎较RTX 更为优越。因此，其治疗效果及作用机制尚需进一步研究。此外，用于FSGS治疗的其他单克隆抗体如adalimumab、fresolimumab、bleselumab 等的相关研究也在逐步探索中。基于此我们推测，在对FSGS 患者的临床治疗中，单克隆抗体疗法或可使长期使用免疫抑制剂的患者减少使用剂量，甚至停用相关激素及免疫抑制剂，在同等疗效的基础上实现不良反应更少、复发率更低，亦可作为传统疗法即激素、激素联合免疫抑制剂疗法等的强有力补充，为SRNS 和难治性肾病综合征患者的临床治疗带来突破。

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