叶绿素及其在动物生产中的应用

■王贺泽 丁宏标 李习龙 毕研亮

（中国农业科学院饲料研究所，北京100081）

植物色素主要有类胡萝卜素、叶黄素、花青素、姜黄素、叶绿素等，它们是主要起着色作用的植物次生代谢物，同时还具有抗氧化等多种活性[1]。叶绿素是一种双羧酸的酯，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个羧基被叶绿醇所酯化，头部含有一个卟啉环，有极性，尾部是叶绿醇（植醇）。叶绿素是高等植物、藻类、细菌进行光合作用的主要色素，可以分为叶绿素a、b、c、d、f 以及原叶绿素和细菌叶绿素等，其中叶绿素a 和叶绿素b 是高等植物叶绿体中主要的叶绿素。

早在1940 年，Gruskin[2]研究发现叶绿素可以用来治疗胃肠道疾病、癌症、贫血。在1998 年，Kiyoka等[3]发现绿茶中的叶绿素a 和叶绿素b 对12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯（TPA，12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）诱导的肿瘤呈剂量依赖性抑制作用。Huws 等[4]发现了原生动物中多不饱和脂肪酸的含量与叶绿体有关。植烷酸的含量和叶绿素的含量有关，青绿饲料中富含叶绿素，有研究表明与饲喂混合日粮相比，饲喂青绿饲料奶牛的牛奶中的植烷酸含量从150 mg/100 g增加到450 mg/100 g[5]。近来也有越来越多的研究表明叶绿素与动物和人类的健康密切相关，Xie 等[6]发现叶绿素可以促进小鼠肝脏和肾脏中铅的排泄，减少铅的积累。Suparmi等[7]发现给小鼠注射叶绿素可以提高血红蛋白和铁蛋白水平，有可能治疗溶血性贫血。但是目前关于叶绿素的研究还很少，本文旨在对叶绿素的专利技术进行分析和总结，为叶绿素的进一步研究提供了参考。

1 专利申请情况

利用中外文数据库检索了近年来与叶绿素相关的专利申请情况，并且对其进行了统计分析。1960年，美国最先申请了从木瓜中回收叶绿素方法的专利，而1985 年我国首次申请叶绿素从蚕沙中提取的专利。通过对2010 年至2018 年专利申请数量的分析，发现与叶绿素有关的专利申请量每年持续上升，表明研究者对本领域的关注度越来越高。从不同国家专利申请量来看，中国虽然申请时间较晚，但是申请量位居第一，约占47%，说明近年我国在叶绿素方面的研究不断取得新的进展。

通过对已经公布的专利分析发现，专利申请主要集中于以下几个领域：叶绿素提取和纯化的方法、叶绿素及其衍生物的应用、检测叶绿素含量的方法及装置等，其中前两者专利申请数量较多，近年来已经成为热门的研究方向。

2 叶绿素来源

叶绿素广泛存在于绿色植物中，生产中用于提取叶绿素的原料主要有蚕沙（蚕的粪便）、蔬菜、小球藻、植物叶片等，其中小球藻是自然界中叶绿素含量最高的生物，大约为4%～6%。而目前国内工业上提取叶绿素大部分使用蚕沙，蚕丝业是我国的传统产业，每年蚕的养殖量不断增加，因此蚕沙产量很大，但是大部分蚕沙没有得到充分的利用，仅仅用作肥料、饲料。蚕沙便宜易得，而且叶绿素含量很高，利用蚕沙不仅可以得到富含叶绿素的产品，使用过的蚕沙还可以继续用作肥料，这样使蚕沙得到了合理充分地利用，提高了其经济价值，但是蚕沙也存在一些缺点：原料比较分散、容易受季节和天气的限制等。

3 叶绿素提取方法

近年随着研究的深入和技术的发展，研究者发明了多种提取方法，使叶绿素提取工艺流程不断地得到完善。

3.1 有机溶剂萃取

有机溶剂萃取是传统提取叶绿素常用的方法，主要工艺流程包括浸提、浓缩、洗涤、干燥等，最常用的有机溶剂有石油醚、乙醇、丙酮等。例如1992 年，公开号为CN1063704 的专利采用有机溶剂萃取的方法从竹叶中获得叶绿素液[8]，这种方法操作复杂，提取速度较慢，耗时比较长，叶绿素容易受到破坏，提取的叶绿素纯度不高，而且有机溶剂成本高、毒性大，残留的溶剂还会对环境造成污染。

3.2 超临界流体萃取

公开号CN101648955 利用超临界流体萃取叶绿素的方法[9]，其是在室温条件下利用无色、无味、无毒的CO2作为提取介质进行萃取，这种方法通过改变温度和压力就可以使溶剂在超临界CO2流体中的溶解度大幅度改变，从而为物质的提取提供了更多的可能。与传统提取方法相比，超临界流体萃取极大地简化了生产流程，提高了生产效率，而且CO2不会对环境造成污染，价格较低，可以循环使用，大大降低了生产成本。

3.3 超声波提取

超声波提取是近来应用越来越广泛的一种方法，超声波可以破碎细胞壁，加速细胞内物质的释放，缩短提取时间。例如公开号CN103145718A 使用了超声波提取叶绿素，在短时间内获得了大量的叶绿素，并且发现超声波时间为15 min 时叶绿素含量最高[10]。公开号CN106854209A 将振荡提取、超声波提取、振荡结合超声波提取三种方式进行比较，发现两种方式联合起来提取的叶绿素含量最高[11]。

3.4 其他提取方法

公开号CN1078750，该专利将水作为溶剂，通过结合酶工程技术，从蚕沙中制取叶绿酸盐[12]，极大地降低了生产成本，节约了资源，同时减少了生产设备的资金投入。公开号CN1634920、CN102093369A 在提取叶绿素前，增加了微波预处理的工艺，破坏了组织细胞，使提取时间和有机溶剂使用量大大减少，提高了提取效率，使叶绿素提取工艺得到了一定的改善[13-14]。公开号CN102206221A 使用无机碱法提取叶绿素[15]，相对于超临界流体萃取成本较低，而且获得的产品中不会残留有机溶剂。 公开号CN103641837A 采取酶解法[16]，使用酶将原料中的大分子物质进行酶解，在较短的时间内可以提取大量的叶绿素。

4 叶绿素及其衍生物的应用

叶绿素极不稳定，光、热、酸、碱等一些理化因素都会使其分解，因此在提取过程中容易使叶绿素受到破坏，这给叶绿素的应用带来了很大的困难，所以常常制成叶绿酸盐后应用于食品、医药、保健等方面，不仅保留了叶绿素原有的卟啉环结构，保持了绿色，而且提高了其稳定性和水溶性，有利于叶绿素更广泛的应用。生产中通常将叶绿素浸提液或叶绿素浸膏通过皂化、酸化等一系列步骤，用铜、锌等其他金属元素代替叶绿素中的镁离子来制取叶绿素衍生物。

4.1 食品添加剂

在食品加工过程中通常会通过添加色素来改善食品的色泽，目前市场上色素主要包括天然色素和合成色素两种，合成色素中含有苯环等许多对人体有害的基团，摄入量过多，对人体有很大的危害，目前一些国家已经禁止使用合成色素。而天然色素是从天然资源中提取的色素，安全、无毒副作用，深受广大消费者的青睐。例如公开号CN103509028A 使用传统的叶绿素提取方法，再进行铜代制备了叶绿素铜钠盐，可以作为食品的着色剂，用于糕点、糖果等食品中改善其色泽[17]。

4.2 保健治病

叶绿素衍生物对人体有许多益处，可以抗肿瘤、抗菌、促进伤口愈合、保护肝脏、治疗贫血等疾病。缺铁是全世界最普遍的微量营养素缺乏，卟啉铁是营养学家普遍认为治疗贫血的最有效的铁源。例如，公开号CN104370923A 用二价铁离子代替镁离子，制备了叶绿素铁锌盐[18]，公开号CN101671341 利用富含叶绿素的原料和硫酸亚铁制备铁叶绿素[19]，可以促进血红蛋白的合成，对治疗缺铁性贫血和再生障碍性贫血有显著的效果。叶绿素对铁的调节有双重作用，公开号CN106902111A 发现叶绿素还可以促进铁的排泄，防止铁过载造成的肝脏、肾脏损伤，而且无副作用[20]。公开号CN1406940 发明了叶绿素铬的制备方法，制造出了具有生物活性的叶绿素铬[21]，其操作简便、成本极低、毒性较低，可用于治疗糖尿病、新生儿黄疸等疾病。公开号CN102199153A 制备的叶绿素铜钠盐在医药上得到了广泛的应用，不仅可以用作食品添加剂、着色剂，还具有抗癌、抗氧化、抗肿瘤等作用[22]。公开号CN110090210A 发现给存在急性微循环障碍的动物注射叶绿素衍生物，血流灌注量、血细胞聚集程度、血细胞运动速率都有所下降[23]，这表明叶绿素衍生物对改善肠系膜微循环障碍有明显的效果。

4.3 饲料添加剂

目前使用的饲料中添加了许多化学物质、人工合成物质等，这些成分会对动物的生长发育和内分泌产生不利的影响，其中一些有害的化学成分还会随着人们的食用进入人体内，从而危害人体的健康。公开号CN101318963A 将从剑、蕃麻叶中提取的叶绿素直接作为饲料添加剂[24]，不仅充分利用了剑、蕃麻叶原料，而且减少了麻渣对环境的污染。公开号CN106578367A 制备了适用于多类饲料的叶绿酸盐[25]，不仅天然、无毒副作用，而且可以提高动物的免疫力，促进动物的生长，改善畜产品的品质。随着近来食品安全事件的频繁出现，人们对畜产品质量的关注度也越来越高。畜禽的肌纤维数量、肌氨酸和硫胺素含量等都会影响畜禽肉品质、风味、口感。公开号CN106632359A 从桑叶渣中提取了脱镁叶绿素，并将其和富马酸亚铁等物质结合使用后，减小了肌纤维的直径，增加了肌氨酸和硫胺素含量，从而改善了肉品质、风味、口感[26]。公开号CN107912606A 在半干青贮饲料中添加叶绿素铜钠盐，有利于维持动物肠道菌群的平衡[27]。公开号CN105995142A 发现在鸭饲料中添加菠菜叶绿素，鸭的产蛋率提高了34.56%，而且鸭蛋品质也得到了改善[28]。

4.4 其他作用

叶绿素已经广泛应用于日常用品中，例如，公开号CN107325106A 利用红豆杉制备了叶绿素浸膏用于化妆行业中，具有美容养颜、抗皱、抗衰老的功效[29]。公开号CN101559031 首次发明了富含叶绿素铜钠的新型花露水[30]，无毒，无刺激，不仅可以驱蚊止痒，还有提高免疫力，抗溃疡等作用。近几年还有许多专利发明了含有叶绿素的牙膏，具有祛除口臭、杀菌消炎、除菌斑、保护牙齿健康的功效。

5 小结

随着科研工作者不断深入地研究，叶绿素的提取方法不断得到改善，而且有越来越多的研究者将叶绿素作为饲料添加剂研究其对动物机体的作用。开发天然色素不仅可以充分地利用自然资源，降低生产成本，还可以减少环境污染，同时青绿饲料中含有丰富的叶绿素，但是养殖行业趋向于集约化大规模发展，使青绿饲料使用量大大减少，开发叶绿素可以避免饲料添加剂的过度使用，从而生产出绿色健康的畜产品。但是目前还有以下几个方面有待进行研究：叶绿素作为饲料添加剂的最佳添加水平；叶绿素对动物的生长性能及其他方面的影响；叶绿素在动物机体的作用途径和机制。因此对于叶绿素还需要做进一步的研究，以最大限度地发挥叶绿素在动物生产中的应用潜力。