CAR-NK细胞：肿瘤免疫治疗的新方法

石亚群，俞妍慧

(1.长治医学院 研究生院，山西 长治；2.长治医学院附属和平医院 血液科，山西 长治)

0 引言

CARs由细胞外抗原结合域(通常是来自单克隆抗体的单链可变片段(ScFv))和细胞内信号域(通常是TCR-CD3ζ链)组成[1]。虽然针对T细胞的CARs技术已广泛用于临床，但对CAR-NK细胞的研究很大程度上仍处于临床前阶段。然而，CAR-T细胞在淋巴系统恶性肿瘤中的不良反应及其针对实体肿瘤的局限性[2]推动了CAR-NK细胞用于临床的进一步研究。

1 NK细胞分类及其优势

自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，NK细胞通过基因编码的抑制性和激活性受体提供的信息来区分自体健康细胞及外来的、受感染的或转化的细胞。在血液中，细胞毒性CD56dimNK细胞和免疫调节CD56brightNK细胞构成了NK细胞的两个主要群体。与T细胞相比，NK细胞具有以下优势：NK细胞介导的细胞毒作用不受HLA限制；同种异体半相合NK细胞不会引起移植物抗宿主病[3,4]；减少了CAR靶向抗原丢失所致的复发或耐药性风险[5,6]；此外，巨细胞病毒诱导的记忆样适应性NK细胞已被证明是长寿和高效的[7]。综上所述， NK细胞的安全性与抗肿瘤能力的结合使其成为CAR技术实施的一颗新星，通过基因修饰引入抗原特异性来增强NK细胞的抗肿瘤反应是目前肿瘤免疫领域研究的热点之一。

2 NK细胞来源

2.1 NK细胞系(NK-92)

目前大多数CAR-NK细胞研究都是用NK-92细胞进行的，NK-92细胞最初来源于非霍奇金淋巴瘤患者中，其在IL-2的作用下激活增殖，在保持一致表型和功能特征的同时可大量扩增[8]。然而，NK-92细胞表面缺乏抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR) 及CD16的表达，因此不能通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞。通过基因工程将高亲和力的CD16受体嵌合到NK-92细胞中有效解决了上述问题，以通过ADCC促进肿瘤消除[9]，但与CD16结合的肿瘤特异性单克隆抗体可能会受到患者体内IgG的竞争性结合。最近，将NK-92细胞与第四代CAR结构结合，称为UniCAR[10]。UniCAR由针对多肽表位E5B9的胞外单链片段可变区、CD28跨膜和胞内共刺激结构域及CD3ζ胞内信号域组成，经修饰表达UniCAR的NK-92细胞可通过被称为靶模块(Testination Module，TM)的双特异性靶分子重定向到肿瘤细胞。与表达CD16的NK-92细胞相比，UniCAR NK-92细胞只被携带E5B9肽表位的TM激活，提供了更高水平的选择性和特异性。此外，通过同时或顺序使用不同的TM，可将相同的CAR-NK细胞重定向到不同的靶细胞，从而实现了其针对靶抗原的高度灵活性[10]。尽管NK-92细胞受到较高的关注度，但因NK-92细胞来自淋巴瘤且有可能感染EB病毒，这使得细胞在输注前必须进行照射[11]。大量研究表明，NK-92细胞在照射后仍保持其细胞毒性，但降低了其在体内的增值性[12]，需通过多次输注进行治疗。

2.2 脐血NK细胞

NK细胞的另一来源是脐带血(CB)，15%-30%的CB淋巴细胞是NK细胞，通常认为它们在表型和功能上比外周血(PB)NK细胞更幼稚。CD16、颗粒酶B、穿孔素和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)在脐血NK细胞中的表达性降低，细胞粘附分子CD2、CD11a、CD18和CD62L的表达也降低。有限的ADCC潜能和粘附分子的减少导致了脐血NK细胞的细胞毒性能力降低[13,14]。较高比例的脐血NK细胞是CD56bright，这导致抑制性受体NKG2A的总体表达增加，该受体的配体HLA-E通常在肿瘤细胞上表达上调，这与肿瘤预后不良相关[15]。因此，NKG2A是一个重要的免疫检查点，在头颈部鳞状细胞癌的发生过程中，NKG2A已成为单克隆抗体治疗的靶点，以促进NK细胞杀伤肿瘤的潜能[16]。与其未成熟特性相一致的是，脐血NK细胞具有较高的增殖能力，并且容易接受细胞因子的刺激。虽然脐带血库使脐血来源的NK细胞成为一种可行的起始产品，但从脐带血中获得的少量NK细胞需经多次细胞分裂，才能获得足够的细胞数量以供输注[13]。尽管如此，临床上的CAR-NK细胞产品已经有来源于脐血NK细胞的，目前正在临床上进行测试[17]。

2.3 外周血NK细胞

大约90%的外周血NK细胞是具有细胞毒性的CD56dimNK细胞，表达大量的抑制性和激活性受体。与脐血NK细胞相比，外周血NK细胞更成熟，其功能更强，但增殖能力降低[18]。无论是在自体还是同种异体情况下，即NK细胞来自HLA匹配或不匹配的供者，以及KIR配体匹配或不匹配的供者，它作为一种过继细胞治疗产品的安全性已通过了大量临床试验的证明[19,20]。使用来自异体且HLA不匹配的外周血NK细胞的临床试验特性大大增加了可供选择的捐赠者数量。将NK细胞分离是一种从健康捐赠者血液中提取有核细胞的方法，它有助于分离足够数量的NK细胞，在输注之前，通常会将这些细胞进一步扩增，并用IL-2或IL-15等细胞因子将其激活。虽然其在血液系统恶性肿瘤(主要是急性髓系白血病)的临床结果很有希望，但临床反应因患者而异，其临床前的体外研究很难预测临床试验结局。

2.4 IPSC来源的NK细胞

诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSC)来源的NK细胞是CAR-NK细胞产品的理想来源，因为其具有无限增殖的潜力[21]，只需要一个CAR转导的IPSC细胞就可以产生通用的现成CAR-NK细胞产品。然而，IPSC来源的NK细胞的研究现处于初级阶段，仍需克服许多挑战才能生产出理想的现成产品。IPSCs通常来源于非造血细胞，与外周血NK细胞相比，其产生的NK细胞具有CD16、KIR低表达，NKG2A高表达的未成熟表型[22,23]。这就提出了一个问题，即当遇到靶细胞时，它们的细胞溶解能力是如何保持和释放的，与NK-92细胞类似，通过基因工程使IPSC来源的NK细胞表达缺乏的表面蛋白(如CD16)是解决这一挑战的有效方案。虽然它们的增殖能力是无与伦比的，但输注后的持久性问题仍然存在，在IPSC来源的NK细胞的潜力被激发之前这些挑战都需得到解决[24]。第一个IPSC衍生的CAR-NK细胞产品(FT596)表达CD19-CAR结构、高亲和力的CD16Fc受体及IL-15受体融合蛋白，并与CD20导向的单克隆抗体联合应用于实验中。该产品不仅解决了IPSC来源的NK细胞有限的持久性及CD16低表达问题，同时还进行了联合免疫治疗试验，其在CD19+淋巴瘤的人源化小鼠的研究中取得了令人振奋的临床前研究结果，这为最近开始的I期临床试验(NCT04245722)铺平了道路。

3 CAR-NK细胞的临床试验

目前ClinicalTrials数据库收集了12项关于CAR-NK细胞的试验，其中6项在积极招募中，6项I期临床试验尚未积极招募。关于CAR-NK细胞的试验主要集中在淋巴瘤和白血病上，其次是针对实体肿瘤的，包括卵巢癌、前列腺癌、脑癌、肝癌、肺癌和胰腺癌。使用NK-92和初级靶向CD33或NKG2D的CAR-NK细胞的小规模临床试验(n=3)结果已被报道[25,26]，而在最近才发表出一项大规模的I/II期临床试验结果[17]。11例CD19阳性的复发难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤患者在接受标准的环磷酰胺/氟达拉滨去淋巴治疗后，接受了脐血来源的CAR-NK细胞产品，其中8例患者(73%)得到缓解，7例(4例淋巴瘤，3例CLL)获得完全缓解，1例Richter’s转化的CLL获得部分缓解，并且没有出现细胞因子释放综合征、神经毒性、移植物抗宿主病等不良反应。在此试验中，尽管输注的NK细胞和受体之间存在严重的HLA不匹配，但输注的CAR-NK细胞仍然扩张，并持续存在至少12个月，IL-15的加入可能在这些CAR-NK细胞的持久性和抗肿瘤活性中发挥了重要作用。

4 CAR-NK细胞的挑战

目前，CAR-NK细胞在临床的实施主要受到三个因素的限制，即NK细胞对基因工程的抵抗；NK细胞有限的增殖能力；输注后的持久性有限。(1) 用逆转录病毒或慢病毒对原代NK细胞进行病毒转导的效率很低，因此对NK细胞进行非病毒转染方式(DNA或mRNA质粒的电穿孔)[27]受到了关注，但电穿孔在CAR构建体中只是瞬时表达，因此不是稳定的CAR-NK细胞基因工程产物的可行方法。现其他非病毒转染方式即DNA转座子[28]及靶向基因整合[29]的研究有望解决这一挑战。(2)目前NK细胞的扩增通常依赖于超生理水平的细胞因子的诱导，通过将IL-15、IL-12和IL-18相结合，已经从小鼠和人NK细胞中获取到细胞因子诱导的记忆样NK细胞，其表现出更强的抗肿瘤反应性和持久性[30,31]。但IL-15可导致NK细胞在体外扩增时对细胞因子成瘾，且呈剂量依赖性，因此当输注扩增的初级NK细胞产品时，需要考虑细胞因子成瘾问题[32]。(3)延长CAR-NK细胞持久性的一种方法是给予全身细胞因子支持，以诱导体内输注产品的增殖，虽然IL-2和IL-15已经在临床试验中进行了测试，但两者都会导致严重的副作用[33]。

5 结语

CAR-T细胞治疗淋巴瘤的临床成功促进了CAR-NK细胞领域的快速发展。FDA批准的第一个转基因细胞产品为CAR-NK细胞的临床应用铺平了道路，但简单地将针对T细胞的优化结构整合到NK细胞中并不是最理想的，且导致细胞活化的生物学分子机制在T细胞和NK细胞之间有很大的差异，因此需进一步考虑如何设计CAR-NK细胞的结构。新方法的开发和现有技术的优化将促进对原代NK细胞进行更有效的基因工程改造，使新一代NK细胞能够取代目前正在临床上测试的NK-92细胞产品。最后，无论是进一步开发基因构建工程，还是寻找最佳NK细胞来源，如果能够解决持久性问题，CAR-NK疗法作为一种新的抗癌免疫疗法将具有巨大的潜力。