獭兔肠道菌群的研究进展

时云朵，孙 豪

（1.四川省水产学校，成都 611730；2.雅安市农业农村局，四川 雅安 625000）

獭兔原产于法国科伦地区，1920年由传教士带入我国，并于2002年由四川省草原科学研究院育成四川白獭兔种系，是一种皮肉兼用的重要经济动物，也是一种常用的试验模式动物[1]。动物的胃肠道，栖息着种类繁多、数量庞大的微生物[2]。在长期的进化过程中，这些微生物与宿主形成一个相互依赖、相互制约的微生态系统。肠道菌群对宿主的免疫、代谢、疾病甚至行为等方面均存在一定联系[3]。獭兔的盲肠具有瘤胃般的作用，其中的微生物能帮助肠道进行食物消化[1]。在獭兔养殖中，饲料改变、气候变化、过量使用抗生素类药等均可导致其肠道菌群失调，引起腹泻[4]。目前，腹泻等消化道疾病己成为獭兔主要的疾病之一[5]。为促进獭兔养殖业的绿色健康发展，现就獭兔道菌群结构及抗生素、益生菌、中药等对獭兔肠道菌群影响进行概述，以期为獭兔养殖的科学用药和微生态制剂在獭兔养殖中的应用提供参考。

1 獭兔肠道菌群结构

1.1 活菌计数法研究獭兔肠道菌群结构

活菌计数法是研究獭兔肠道菌群的重要方法之一，主要采用特殊培养基，对獭兔胃肠道中可培养菌进行活菌计数研究。刘亚娟等采用活菌计数法研究断奶獭兔盲肠菌群，发现其盲肠中乳酸杆菌数量达107.65cfu·g-1、双歧杆菌数量达107.72cfu·g-1和大肠杆菌数量达106.79cfu·g-1，并认为一定浓度的葡萄糖氧化酶能显著提高盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌数量、降低大肠杆菌数量[6]。同样，吴峰洋等也采用活菌计数法研究了断奶獭兔盲肠菌群中乳酸杆菌、双歧杆菌数量和大肠杆菌的数量，发现每克盲肠内容物3种菌的数量与刘亚娟等的研究结果在同一个数量级，并认为魔芋甘露寡糖能改善獭兔盲肠菌群组成[6-7]。而左晓磊等采用活菌计数法发现獭兔盲肠中乳酸杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌数量分别达 108.06、107.99、105.65、104.93cfu·g-1，其中乳酸杆菌、大肠杆菌的数量与上述两项研究结果高一个数量级，这可能与不同的基础日粮有关系[8]。此外，齐聪岩等采用活菌计数法研究了獭兔盲肠菌群，发现其盲肠中含有大量的大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌，且处于动态变化中，并认为发酵玉米秸秆可降低大肠杆菌数量，提高乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌的数量，最终改善肠道微生态环境[9]。从上述研究可见，采用活菌计数法研究獭兔肠道菌群结构主要集中在饲料添加物对其盲肠中常见的几种可培养菌的研究上，未见采用此方法直接研究獭兔肠道菌群的报道，且鲜见对獭兔全肠道或软硬粪便菌群的研究，说明采用活菌计数法研究獭兔肠道菌群中只能集中在点上，不能全面反映肠道菌群结构。

1.2 分子鉴定法研究獭兔肠道菌群结构

分子鉴定方法是基于16SrDNA 扩增菌群核酸序列，最终以图谱形式进行展示、比较分析或结合克隆测序反映獭兔胃肠道菌群结构。Guo等采用16SrRNA反转录克隆测序法成功鉴定一株源于獭兔肠道的细菌为双链球菌[10]。任传帅等根据细菌16SrDNA 的V3 可变区基因序列设计特异性引物，采用实时荧光定量PCR 技术研究了獭兔十二指肠、空肠、回肠和盲肠肠壁中的菌群结构，揭示了32 日龄和46 日龄獭兔各肠壁中拟杆菌、梭菌属、韦荣球菌和大肠埃希菌的定植量，并认为獭兔的软粪液和小肠液对拟杆菌、梭菌属、韦荣球菌的定植有促进作用，而对大肠埃希菌的定植影响较小[11]。周毅等采用PCR-DGGE 和Real-Time PCR技术比较分析健康与腹泻獭兔盲肠菌群结构的差异，发现健康与腹泻獭兔盲肠菌群丰富度、多样性指数差异不显著（P＞0.05），但腹泻獭兔盲肠菌群结构有复杂化的趋势；腹泻獭兔盲肠菌群中普雷沃氏菌、梭菌类群Ⅰ数量与健康獭兔的差异不大，而链球菌属、梭菌类群Ⅳ和ⅩⅣa、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、普拉梭杆菌等有益菌数量显著降低，埃希氏大肠杆菌数量显著升高，认为獭兔发生腹泻后盲肠有益菌数量降低，有害菌数量升高；同时，还分析了獭兔十二指肠、空肠、回肠和盲肠的肠道菌群结构，发现獭兔从十二指肠到盲肠的菌群丰富度呈“V”字形变化，空肠中菌群丰富度最低[12-13]。从上述研究可见，多种分子鉴定法已广泛应用于獭兔肠道菌群研究中，可更快速、更直观、更全面展示獭兔肠道菌群结构，加深人们对獭兔肠道菌群的认识，但不能全面量化反映菌群结构及代谢关系等。

1.3 高通量测序研究獭兔肠道菌群结构

近年来，随着二代测序技术的迅猛发展，高通量测序方法被用于獭兔肠道菌群研究中，使得人们对其肠道菌群有了更深入的了解。Zeng 等首次采用高通量测序方法对比分析不同粪便类型（硬粪和软粪）的菌群结构，并揭示兔獭粪便菌群与宿主体重的关系，发现獭兔的粪便菌群主要为拟杆菌属、梭菌属、瘤胃菌科、疣微菌科、柔膜细菌目、瘤胃球菌属、毛螺菌科、肠杆菌科、蓝藻细菌等的细菌，不同体重獭兔的硬粪菌群结构差异较大，高体重獭兔硬粪菌群中有41 种菌显著低于低体重的（如拟杆菌、乳酸菌、普雷沃斯菌等，P＜0.05），但软粪菌群结构在高低体重间差异不显著（P＞0.05），同时高体重獭兔的软粪菌群中有44 种菌显著高于硬粪的（如瘤胃菌科、疣微菌科）等细菌，有7种在硬粪中丰富度更高；对差异菌群功能基因进行预测分析发现，高体重獭兔α-亚麻酸代谢、芪类/二芳基庚烷/姜辣素生物合成代谢途径丰度高于低体重的，且高体重獭兔软粪中有4种与有毒物质（如二甲苯、二噁英等）降解有关的代谢途径丰富度更高；獭兔的软粪菌群中有26条路径（如各种N-聚糖生物合成）更为丰富，獭兔的硬粪菌群中仅有4条途径更为丰富，此研究系统揭示了獭兔粪便菌群多样性及其与体重的关系[14-15]。高通量测序方法不能区分死菌与活菌，为了解獭兔胃肠道的总菌与活菌的差异，Fu 等采用改进的单叠氮丙啶试验结合二代测序的方法比较分析了獭兔胃、空肠、回肠、盲肠和结肠的总菌与活菌间的差异，发现其前肠菌群具有非常低的活菌比例（胃、空肠和回肠中分别仅有1.12%、1.2%和2.84%），其后肠具有非常高的活菌比例（盲肠中有24.66%，结肠中有19.08%）；梭菌属、瘤胃菌科等3 种菌群是后肠中的最优势菌群，丰度虽发生了改变，但优势顺序未发生改变[16]。而在前肠菌群中，不仅菌群丰度发生了改变，优势顺序也发生了改变，不动杆菌属菌群变为最优势的菌群，α多样性和β多样性也存在显著差异，通过网络分析发现总菌与活菌的菌群结构几乎完全不同，认为獭兔胃肠道中的总菌不能代表活菌，尤其在獭兔的前肠菌群研究中[17]。上述研究发现，高通量测序方法使得人们对獭兔肠道菌群有更深入的认识，揭示肠道菌群与宿主部分代谢途径的关系，并提出利用高通量测序方法研究肠道菌群的注意事项，但对于獭兔胃肠道中活菌比例总体较低的研究，可能与胃肠道中许多微生物是“见光死”有关。Fu 等的试验样品是从死后獭兔胃肠道中取出内容物，并不能排出菌群是离开肠道后死亡的可能，其研究结果中总菌和活菌的菌群结构完全不同也可能佐证了较大一批微生物是离开胃肠道后死亡的，因此，獭兔胃肠道中总菌能否代表活菌及其比例有待进一步研究[16]。同时，菌群间、菌群与宿主间的相互作用机制，仍需多学科、多组学进一步研究。

2 抗生素、微生态制剂在獭兔中的应用研究

2.1 抗生素对獭兔肠道菌群影响研究

动物饲料中添加抗生素必将被逐渐取消，但为了在獭兔养殖中科学使用抗生素，大量研究报道了多种抗生素作为饲料添加剂对獭兔肠道菌群的影响。邹芙沁等采用PCR-DGGE 和荧光定量PCR方法研究了杆菌肽锌对断奶獭兔盲肠菌群的影响，发现杆菌肽锌对獭兔盲肠菌群丰富度、多样性和均匀度等影响不大，但能显著降低梭菌类群ⅩⅣa 的数量，认为杆菌肽锌作为断奶獭兔饲料添加剂，对其盲肠菌群结构没有显著影响[18]。同时，杨明月等也采用了相同方法研究了硫酸粘杆菌素对断奶獭兔盲肠菌群的影响，发现硫酸粘杆菌素对獭兔盲肠菌群多样性影响不大，但能显著提高梭菌类群ⅩⅣa、肠球菌属、链球菌属丰度，显著降低梭菌类群Ⅳ的丰度，认为一定浓度的硫酸粘杆菌素不能引起獭兔盲肠菌群失调[19]。此外，文斌等也采用上述方法分析金霉素对断奶獭兔盲肠菌群的影响，发现金霉素对獭兔盲肠菌群结构和多样性等影响不大，但能显著提高普雷沃氏菌属数量，推测金霉素的添加可能促进獭兔的体重增长[20]。Zou等采用高通量测序方法分析了杆菌肽锌、硫酸粘杆菌素和金霉素对断奶獭兔盲肠菌群的影响，发现獭兔盲肠中的优势菌群为厚壁菌门的细菌，其次是拟杆菌门的细菌；金霉素组盲肠菌群中拟杆菌门与厚壁菌门的比值比杆菌肽锌组的更高，杆菌肽锌组的变形杆菌门和乳酸杆菌属细菌丰度显著降低，而硫酸粘杆菌素组的乳酸杆菌属细菌丰度显著提高；此外，硫酸粘杆菌素组和杆菌肽锌组的优势菌群均为瘤胃球菌属，尤以白色瘤胃球菌为主，杆菌肽锌组的粪球菌比例显著升高，金霉素组与对照组的盲肠菌群结构相似，认为抗生素的使用可能导致獭兔盲肠菌群发生变化，并推测獭兔盲肠菌群对金霉素存在较高耐药性[21]。上述研究发现，部分抗生素可作为獭兔饲料添加剂，但应注意添加剂量，并严格监控耐药性。

2.2 益生菌对獭兔肠道菌群影响研究

益生菌是抗生素的重要替代品。大量研究表明，益生菌可改善獭兔胃肠道菌群结构，促进其生长发育[22-26]。Wang等比较分析两株乳酸杆菌对断奶獭兔十二指肠、空肠和盲肠中菌群结构的影响，乳酸菌可改变獭兔肠道菌群，特别是盲肠内的微生物多样性和丰度，认为应用合适的乳酸菌可调节獭兔肠道微生态系统[27]。同样，Zhou等研究不同浓度的布氏乳杆菌对断奶獭兔肠道菌群的影响，发现不同浓度的布氏乳杆菌均可显著提高獭兔十二指肠、空肠、盲肠的菌群香农指数、丰富度和均匀度，仅低浓度的布氏乳杆菌可显著提高回肠的菌群香农指数、丰富度和均匀度，且不同浓度的布氏乳杆菌均可提高十二指肠、空肠、回肠中菌群的丰度，并不同程度的抑制大肠杆菌的丰度，认为布氏乳杆菌能增加獭兔肠道菌群丰富度，提高有益菌群数量，抑制部分有害细菌增殖，适量添加布氏乳杆菌有助于提高獭兔饲料利用率[13]。此外，Liu 等研究不同浓度的丁酸梭菌对断奶獭兔肠道菌群的影响，此试验是从怀孕獭兔开始饲喂不同浓度的丁酸梭菌，待其产子断奶后，对断奶獭兔继续饲喂对应浓度的丁酸梭菌，发现丁酸梭菌能增加断奶獭兔肠道中益生菌群丰度，认为其可改善獭兔肠道微生物群[28]。上述研究可见，所用益生菌均非獭兔源益生菌，提示獭兔源益生菌的筛选应用研究有待进一步加强[29-31]。

2.3 中草药等对獭兔肠道菌群影响研究

近年来，有大量研究表明中草药可改善獭兔胃肠道菌群结构[32-35]。吴峰洋等研究了魔芋甘露寡糖对生长獭兔肠道菌群的影响，发现不同浓度的魔芋甘露寡糖均能降低盲肠中大肠杆菌数量，提高双歧杆菌丰度，并呈现浓度依耐性，且能提高乳酸菌含量，认为魔芋甘露寡糖能改善獭兔盲肠菌群组成[7]。同时，左晓磊等研究不同水平的纯中药饲料添加剂对生长獭兔肠道菌群的影响，发现中草药可显著降低獭兔的腹泻率，能抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌增殖，调节乳酸杆菌等有益菌的代谢，认为中草药可促进生长獭兔肠道微生态系统的稳定[8]。此外，孙海涛等研究玉屏风多糖合生元对断奶獭兔肠道菌群的影响，发现玉屏风多糖和玉屏风多糖合生元均能显著提高獭兔空肠和回肠中菌群多样性和总菌、拟杆菌门、厚壁菌门、普雷沃氏菌属、丁酸弧菌和梭菌类型的丰度、降低肠球菌属数量，认为玉屏风多糖和玉屏风多糖合生元可改善獭兔空肠和回肠菌群结构[32]。上述研究可见，中草药在獭兔养殖上的应用研究较多，但具体机制等有待进一步研究。

3 小 结

獭兔是一种皮肉兼用的小型草食动物，具有较高的经济价值。经过多年的研究，已初步认识了獭兔肠道菌群的基本构成及与部分代谢途径的关系，然而还鲜见獭兔源益生菌的筛选应用研究，且菌群间、菌群与宿主间的相互作用机制，中草药改善獭兔菌群结构的作用机制，以及肠道中真菌、古细菌、病毒等微生物的研究，均需多学科、多组学进一步研究。