2019年浙江和福建沙门氏菌和弯曲杆菌的耐药性分析

唐 标，陈凌云，罗 怡，3，施杏芬，胡 骥，陈怡飞，钱鸣蓉，杨 华，*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，浙江 杭州 310021； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 3.中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018； 4.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 310020)

沙门氏菌(Salmonella)和弯曲杆菌(Campylobacter)是最常见的2类食源性致病菌，可引起腹泻、菌血症等多种严重危害人体健康的感染性疾病[1-3]。近年来，抗生素因其有效的促生长和预防疾病的作用在畜禽养殖中得到了大量使用，但也引发了严重的动物源和食源性的细菌耐药性问题[4-5]。沙门氏菌和弯曲杆菌是动物肠道中的常见致病菌，耐药菌株可以在养殖场传播给养殖从业人员，同时通过屠宰、运输和销售环节传播给消费者。作为耐药基因储藏库，耐药菌株携带的多种获得性耐药基因能够通过水平转移途径(质粒、转座元件等)向人、环境传播扩散，从而加速细菌耐药性水平的提高[6-8]。食源性致病菌的源头可追溯至养殖动物，耐药性问题现已成为控制畜产品质量安全的新课题。据Zhang等[9]的报道，2008—2012年在上海和河南分离的145株鼠伤寒沙门氏菌对头孢噻呋、氨苄西林、四环素、庆大霉素、复方新诺明的耐药性分别是49.0%、47.6%、45.5%、35.2%、32.4%，77.2%的鼠伤寒沙门氏菌对至少3种抗生素耐药；Jiang等[10]报道，2017年在河南省猪场分离的沙门氏菌，主要血清型为鼠伤寒和德尔卑，对环丙沙星、四环素、多西环素、磺胺异恶唑和氨苄西林的耐药率均超过80%。弯曲杆菌近年来的耐药率同样较高，据Zhang等[11]报道，华南地区2017—2019年从禽肉和人上分离的弯曲杆菌对萘啶酸、环丙沙星、四环素、氟苯尼考的耐药率分别是91.9%、88.5%、87.2%、46.6%。如上所述，动物源细菌在不同时间、不同地区的耐药性均已处于较高水平，但其具体表现也存在一定的差异；因此，对上述2类病原菌的耐药性水平进行动态监测非常必要。

本研究在浙江省和福建省的养殖场、禽交易市场采集粪便、肛拭子样品，分离沙门氏菌和弯曲杆菌，随后进行血清型分型、药敏试验，获得其耐药性特征，以期为当地的公共卫生安全和动物源细菌耐药水平控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2019年7—11月，在浙江省宁波、嘉兴、金华、温州、绍兴5市的8个鸡养殖场和禽交易市场、2个鸭场、2个猪场随机采集新鲜畜禽粪便和肛拭子样品共计1 000份，在福建省福州、南平、厦门、莆田、漳州5市的6个鸡场、1个鸭场、4个猪场采集粪便和肛拭子样品共计480份。采集的样品均来源于健康动物。样品采集后置于低温(2～8 ℃)采样箱中，当日运回实验室，进行沙门氏菌和弯曲杆菌分离前的处理工作。

1.2 主要试剂

LB琼脂培养基、LB肉汤培养基、缓冲蛋白胨水(BPW)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、Swarm琼脂培养基，均购自北京陆桥技术股份有限公司；沙门氏菌、弯曲杆菌显色培养基，购自法国科玛嘉(Chromagar)；HCCA基质溶液，购自德国布鲁克(Bruker)公司；Premix PrimeSTAR HS试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自上海捷瑞生物工程有限公司；沙门氏菌诊断血清，购自丹麦SSI公司；药敏检测板，购自上海星佰生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 沙门氏菌和弯曲杆菌分离培养

参考国家标准GB 4789.4—2016和GB 4789.9—2014分别进行沙门氏菌和弯曲杆菌的分离培养。刮取纯化后的菌落保存在25%(体积分数)甘油冻存管中，保藏于-80 ℃冰箱。

1.3.2 菌株鉴定

将1.3.1节分离到的疑似菌株接种划线至LB琼脂培养基上，(36±1)℃条件下培养16～24 h，随后使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)方法对沙门氏菌和弯曲杆菌进行鉴定：使用无菌牙签挑取疑似单菌落于靶板孔中，涂抹均匀后滴加1 μL的70%(体积分数)甲酸，室温条件下自然风干10 min，随后滴加1 μL HCCA基质溶液，室温干燥10 min。使用MALDI Biotyper RTC软件[12]进行数据自动采集与分析。

1.3.3 沙门氏菌血清分型

将待测沙门氏菌划线至LB琼脂培养基上，(36±1)℃条件下培养16～18 h。滴加适量O价血清于透明平皿上，随后使用无菌牙签挑取适量菌体于O价血清上，涂抹均匀，10～30 s后观察凝集反应，记录发生凝集反应的O价血清类别。挑取LB琼脂培养基上的沙门氏菌单菌落，在Swarm琼脂培养基的中心位置转接，(36±1)℃条件下培养16～18 h，挑取菌落边缘适量菌体于H价血清上，记录发生凝集反应的H价血清类别。最后对照Kauffman-White沙门氏菌诊断抗原表，查询最终血清型。

1.3.4 药物敏感性试验

参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100-S25文件推荐的微量肉汤稀释法，使用药敏检测板测定沙门氏菌分离株对16种常见抗生素——氨苄西林(AMP)、奥格门丁(A/C)、庆大霉素(GEN)、大观霉素(SPT)、四环素(TET)、氟苯尼考(FFC)、磺胺异恶唑(SF)、复方新诺明(SXT)、头孢噻呋(CEF)、头孢他啶(CAZ)、恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美罗培南(MEM)、安普霉素(APR)、黏菌素(CL)和乙酰甲喹(MEQ)的药敏表型，检测弯曲杆菌对9种抗生素——阿奇霉素(AZM)、环丙沙星(CIP)、红霉素(ERY)、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、萘啶酸(NAL)、泰利霉素(TEL)和克林霉素(CLI)的药物敏感性。质控菌株分别为大肠埃希菌ATCC 25922和空肠弯曲杆菌ATCC 33560。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌和弯曲杆菌的分离情况

在浙江省采集的1 000份样品中分离到沙门氏菌56株，在福建省采集的480份样品中分离到沙门氏菌44株。所有沙门氏菌均通过MALDI-TOF-MS和血清凝集试验进行了确认。在合计分离到的100株沙门氏菌中，共有94株确定了血清型(另有6株未鉴定出)，包括策维埃(19株)、肯塔基(15株)、韦太夫雷登(15株)、鼠伤寒(14株)、肠炎(14株)、阿贡纳(6株)、罗森(5株)、Ⅱ(2株)、查理(2株)、图莫迪(1株)和埃森(1株)11种血清型，其中以策维埃血清型分布最广(图1)。

图1 分离到的沙门氏菌的血清型分布Fig.1 Serotype distribution of isolated Salmonella strains

在采集的样品中共计分离到100株弯曲杆菌，其中，分离自浙江样品的有82株，分离自福建样品的有18株，均通过MALDI-TOF-MS进行了验证。

2.2 沙门氏菌和弯曲杆菌的耐药情况

就分离的100株沙门氏菌对16种抗生素的耐药性进行了最小抑菌浓度(MIC)检测，其中，安普霉素和乙酰甲喹由于未定义折点，暂未统计。分离到的沙门氏菌对14种抗生素的耐药率分别为氨苄西林70%、奥格门丁6%、庆大霉素42%、大观霉素44%、四环素76%、氟苯尼考58%、磺胺异恶唑65%、复方新诺明53%、头孢噻呋23%、头孢他啶19%、恩诺沙星24%、氧氟沙星20%、美罗培南0、黏菌素12%。耐药率最高的3种抗生素分别为四环素、氨苄西林和磺胺异恶唑，均大于60%(图2-A)。根据测得的MIC分布规律来看，沙门氏菌对大部分抗生素的MIC分布较广，耐药和敏感MIC边界明显。其中，有超过30%的菌株对氨苄西林、大观霉素、氟苯尼考、磺胺异恶唑等的MIC大于256，表现出很高的耐药水平(图3)。沙门氏菌对奥格门丁的耐药率较低；对美罗培南则全部敏感，MIC≤0.03；对黏菌素的MIC值连续，在0.25～4。

图2 分离到的沙门氏菌(A)和弯曲杆菌(B)的耐药率Fig.2 Antimicrobial resistance rates of isolated Salmonella(A) and Campylobacter(B) strains

100株弯曲杆菌对9种抗生素的耐药率分别为环丙沙星99%、萘啶酸88%、庆大霉素23%、四环素87%、克林霉素63%、红霉素43%、阿奇霉素58%、泰利霉素42%、氟苯尼考29%。其中，对庆大霉素的耐药率最低，而对环丙沙星、萘啶酸和四环素的耐药率均超过80%(图2-B)。供试的对庆大霉素、四环素、克林霉素、红霉素、阿奇霉素耐药的菌株中，大部分的MIC均超出试剂盒的测定范围(图4)。

2.3 多重耐药分析

分离到的100株沙门氏菌中，有15株对测定的所有抗生素均敏感，其余85株菌的耐药表型有28种，其中，以AMP-GEN-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-CAZ-ENR-OFL的耐药表型占比最高，共有18株菌，其次是AMP-SPT-TET-FFC-SF-SXT，共有8株菌，说明沙门氏菌的多重耐药现象较为普遍(表1)。

表1 分离到的沙门氏菌的耐药谱

分离到的弯曲杆菌中仅有1株菌对测试的9种抗生素全部敏感，其余菌株共有25种耐药表型。其中，CIP-NAL-TET耐药表型的比例为21%，与环丙沙星、萘啶酸和四环素是弯曲杆菌耐药率前3的抗生素排名相吻合。CIP-NAL-TET-CLI-ERY-AZM-TEL、CIP-TET-CLI-ERY-AZM-FFC表型的占比均为11%。从耐药谱可以看出，大环内酯类抗生素——红霉素、克林霉素、阿奇霉素的耐药相关性高，喹诺酮类抗生素——环丙沙星、萘啶酸的耐药表型大都同时出现，表现出菌株对同类药物的交叉抗性。对比发现，弯曲杆菌相比沙门氏菌对已检测的抗生素的耐药水平更高，且同样表现出了高水平的多重耐药特征。

图3 分离到的沙门氏菌对16种抗生素的MIC分布Fig.3 MIC distributions of isoltaed Salmonella strains to 16 antibiotics

图4 分离到的弯曲杆菌对9种抗生素的MIC分布Fig.4 MIC distributions of isolated Campylobacter strains to 9 antibiotics

表2 分离到的弯曲杆菌的耐药谱

3 结论与讨论

沙门氏菌是国内重点关注的食源性致病菌，也是流行性规律研究相对较多的病原菌。本研究于2019年从浙江和福建2省分离动物源沙门氏菌共计100株，其中94株沙门氏菌的血清型被鉴定出来。统计发现，流行性最广的5种血清型分别为策维埃、肯塔基、韦太夫雷登、鼠伤寒、肠炎，这与Tang等[13]报道的2018年印第安纳、鼠伤寒、肠炎为主要流行血清型的结果不一致。本研究并未分离出印第安纳这一常见血清型[14-15]，说明动物源沙门氏菌的流行性在动态变化，采样地点、采样时间和样本量的差异都会造成研究结果的差异。因此，沙门氏菌在畜禽养殖中的常规化监测仍须持续进行。

本文进一步对分离到的沙门氏菌和弯曲杆菌的耐药性进行了统计分析。动物源致病菌的耐药性是近年来的研究热点，据报道，其耐药性与兽用抗生素的使用情况呈正相关[16]。四环素类、磺胺类、喹诺酮类和青霉素类均是畜禽养殖过程中饲料添加和治疗使用的常用药物[17-19]。本研究通过对沙门氏菌进行16种药物、对弯曲杆菌进行9种药物的MIC测定发现，分离到的沙门氏菌对四环素、氨苄西林和磺胺异恶唑的耐药率最高达76%，分离到的弯曲杆菌对环丙沙星、萘啶酸和四环素的耐药率最高可达99%。美罗培南是临床治疗革兰氏阴性菌感染使用的碳青霉烯类药物[20]，在动物养殖中禁用，所以在动物中的耐药菌检出率远低于人。本研究在100株沙门氏菌中未发现美罗培南耐药菌株，符合预期。然而，这并不代表畜禽养殖过程中不存在美罗培南的耐药菌株。根据先前研究，通过筛选仍能获得美罗培南耐药菌株[21]。另外，黏菌素作为促生长药物长期在饲料中添加，且用量较大，但于2017年被禁止在动物养殖中使用[22]。新近的报道指出，2019年大肠埃希菌对黏菌素的耐药率下降[23]。然而，本研究中分离到的沙门氏菌对黏菌素耐药的比例仍超过10%，说明细菌耐药性的下降趋势在不同菌种里稍有不同，控制动物源细菌的耐药水平是一个长期的过程。

总体来说，本研究中的沙门氏菌和弯曲杆菌耐药性水平高，多重耐药性非常普遍，其中，沙门氏菌最高抗11种药物，且占比18%。造成这一现象的原因，从根本上说是多种药物共同选择的结果，而后，多种获得性耐药基因极有可能通过质粒或转座元件介导，整合在菌株基因组或质粒上[7，24-25]。因此，多重耐药菌的传播会使得对细菌耐药性水平的控制更加困难。要降低动物源细菌的耐药性，应在畜禽养殖环节控制抗生素的使用，加强对畜禽养殖和相关产品细菌耐药性的监测，以切实保障公共卫生安全。