南昌市辣椒疫病病原鉴定

强 遥， 广业兰， 秦双林， 张凯东， 杨渭澄， 蒋军喜*

(1.江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045； 2.上海市崇明区长兴镇农业技术服务中心，上海 201913)

辣椒疫病是危害辣椒的主要病害之一[1]，近年来在江西省南昌市发生严重，对当地辣椒产量和品质造成严重影响。该病可危害辣椒茎杆、叶片和果实等部位，在病部产生暗绿色大面积软腐症状，导致植株萎蔫直至死亡[2]。辣椒疫病的病原物为色菌界(Chromista)卵菌门(Oomycota)疫霉属(Phytophthora)真菌，其主要种类为辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)[3-4]，但寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)也能引起辣椒疫病[5-6]。辣椒疫病作为南昌市一种重要的蔬菜病害，已从病原菌生物学、品种抗性及杀菌剂筛选等多方面进行了研究[7-8]，但未见对其进行系统病原鉴定的研究报道。鉴于此，从南昌市辣椒田间采集病样，采用病原菌分离培养、回接致病性观察及形态学和分子生物学相结合鉴定南昌市辣椒疫病的病原菌种类，以期为该病的防治和进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株 2019年7月从南昌市郊采集呈典型症状的辣椒疫病病株。

1.1.2 试剂 Ezup 柱式真菌基因组DNA提取试剂盒，上海生工生物工程有限公司；ITS1/ITS4通用引物，2×Taq PCRMaster Mix，北京天根公司；5×TAE 缓冲液、无水乙醇、75%乙醇、0.1%升汞、琼脂糖及2000 DNA marker，市购。

1.2 方法

1.2.1 病菌分离及纯化 根据《植病研究法》[9]中描述的组织分离法，对病株样品进行病菌分离。从病斑的病健交界处剪取3 mm×3 mm大小的组织块，先将其在75%乙醇溶液中浸泡15 s，再用0.1%的升汞溶液消毒30 s，无菌水冲洗3次。随即将处理好的组织块移入胡萝卜培养基(CA)平板上并置于26℃培养箱中培养，待菌落长出后挑取菌落边缘的菌丝体进行病原菌纯化，将获得的菌株置于4℃下保存备用。

1.2.2 病原菌致病性测定 纯化后的菌落培养性状和形态特征一致，从中随机选取2个菌株L1和L2测定其致病性。将分离获得的菌株分别接种在CA平板上于26℃培养5 d，打取直径5 mm的菌饼，同时制备浓度为1×106个/mL游动孢子悬浮液，分别采用菌饼接种法和游动孢子悬浮液针刺法对6叶期健康辣椒幼苗叶片和茎杆中部接种，并接种空白培养基和蒸馏水作对照。每个处理接种3株辣椒，3次重复。将接种幼苗在26℃培养箱内保湿培养，每天观察和记载发病情况。

1.2.3 病原菌的鉴定

1) 形态学。将待鉴定菌株接种在CA平板中央，26℃、12 h/12 h光暗培养，逐日观察菌落生长情况。待病原菌产生孢子囊后制片，在光学显微镜下观察病原菌菌丝隔膜的有无、游动孢子囊以及游动孢子的形态特征，将获得的观察结果与文献[10-12]对照，从形态上鉴定病原菌。

2) 分子生物学。随机选取2个菌株进行分子生物学鉴定。将各菌株接入PDB培养基中26℃、160 r/min振荡培养3 d，过滤菌丝体，用液氮研磨成粉末，采用Ezup柱式真菌基因组DNA提取试剂盒按其说明提取病原菌基因组DNA。利用真核生物通用引物ITS1/ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对提取的病原菌基因组DNA进行rDNA-ITS序列扩增。反应总体积25 μL：ITS1 /ITS4各1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃补平10 min。获得的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测得的原始序列用DNAStar (Madison Wisconsin, USA)进行数据处理，用Blast工具在GenBank中进行序列同源性搜索，取相似性最高的序列和测定序列在Clustal V程序中进行完全比对，然后利用Mega 5.0以邻位相连(Neighbor-joining，NJ)算法构建系统发育树[13-14]。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及形态特征鉴定

从病样中共分离获得16种真菌菌株，其培养性状和形态特征一致。从图1看出，在CA平板上菌落呈白色，边缘整齐，菌丝稠密呈绒毛状，气生菌丝中等茂盛；菌落生长速率为13.5 mm/d，7 d后长满整个平板。镜检发现，初期菌丝一般无隔，老熟菌丝或菌丝产生游动孢子囊时有隔。孢子囊卵圆形或近球形，有乳突，孢子囊大小(25.00～50.00) μm×(21.25～40.00) μm，长宽比1.00～1.50。孢子囊在水中释放游动孢子，游动孢子肾形，双鞭毛。综合菌落形态、孢子囊及游动孢子形态大小，结合文献[10-12]的形态特征描述，将辣椒疫病病原菌初步鉴定为辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)。

2.2 分离病原菌的回接试验

从图2看出，辣椒疫病在田间危害茎杆、叶片和果实等各部位，茎杆发病主要发生于茎基部及枝杆分叉处，病部暗绿色，皮层软腐，易导致植株部分或全株萎蔫死亡；叶片和果实可在任意部位发病，病部表现大面积暗绿色软腐，很快导致整叶和整果腐烂；田间潮湿时，在各病部表面易见一层白色稀疏的霉层。从图3看出，菌饼接种，3 d后辣椒叶片出现大面积暗绿色水渍状腐烂症状；游动孢子悬浮液接种茎杆，3 d后辣椒幼苗出现茎杆缢缩，5 d后出现整株萎蔫现象，1周后辣椒幼苗干枯致死，症状与辣椒疫病自然发病症状相符。对接种发病的病叶和病苗进行病原菌再分离，通过菌落和病原菌形态观察以及ITS序列分析，表明再分离的病原物与原接种病菌一致。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

从图4看出，菌株L1和L2的基因组DNA经rDNA-ITS区的PCR扩增后，均获得长约840 bp的DNA片段；序列测定表明，2个菌株的rDNA-ITS的序列长度均为801 bp(不包括两端引物序列)且序列完全相同，其在GenBank中的序列登录号分别为MT740810和MT880222。将该片段序列在NCBI数据库中进行Blast比对的结果显示，菌株L1和L2与PhytophthoracapsicaOCPC13(登录号：KC677815)的序列同源性最高，达99.88%。从GenBank数据库中选取疫霉属不同种的ITS序列，以Peronosporacacuminis作为外群构建系统发育树(图5)，菌株L1和L2与辣椒疫霉菌的rDNA-ITS 聚在一起，而外群菌株Peronosporacacuminis则以较远的亲缘关系处在系统发育树的外围。结合系统发育分析和菌株的形态特征及培养性状，最终确定菌株L1和L2为辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。

3 结论与讨论

通过对南昌市辣椒疫病样品进行病原菌分离，共获得16个培养性状结果一致的真菌菌株，其具有相同的形态特征和大小测量值，且与文献[8,10]对辣椒疫霉的形态特征和测量值相符；随机选取2个菌株测定其rDNA-ITS序列，结果其序列完全相同且与GenBank中辣椒疫霉的对应序列具有99.88%的同源性；2个菌株的rDNA-ITS序列与辣椒疫霉菌在rDNA-ITS系统发育树上处于同一分支；确定南昌市辣椒疫病的病原菌为辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)。