赪桐石油醚提取物的化学成分及其对斜纹夜蛾的杀虫活性

田 雯， 薛 站， 霍晓敏， 周康盛， 卫亚丽， 肖 丽， 吴良艳， 谭承建*

(1.贵州民族大学 民族医药学院，贵州 贵阳550025； 2.贵州民族大学 化学工程学院，贵州 贵阳550025)

赪桐〔Clerodendrumjaponicum(Thunb.) Sweet〕为马鞭草科大青属植物，主要分布在湖南、广东、云南、贵州及四川等省，生长于平原、山谷和溪边等地域。赪桐花具有宁心、镇静、安神和止外伤出血功效，主要用于心率失常、失眠及痔疮出血的治疗；叶可祛风化瘀、解毒消肿，主要用于慢性神经血管性疾病、瘀伤及痈肿的治疗；根和茎可以清热利尿、凉血止血，常在肺热咳嗽、热淋、血热出血、咯血、痔疮出血和类风湿性关节炎等方面应用。研究表明，赪桐根石油醚及水提取物有较强的抗炎效果[1-2]。

目前，从赪桐中已分离鉴定出30多个化合物[3-5]，主要为萜类、苯乙醇苷类及环肽类等类型[3，6]。化学成分的研究主要集中于中等极性和水溶性部位，而对其石油醚部位的研究较少。此外，赪桐会散发出刺鼻的气味，从化学生态学角度看，可能是由于赪桐在漫长生长过程中形成的竞争适应，其中的挥发性成分，可能是防止食植性昆虫侵扰的化学防御物质。

斜纹夜蛾(Spodopteralitura)以幼虫危害，可啃食蔬菜、作物和果树等99科290余种植物，其中喜食甘蓝、白菜、莲藕、蕹菜、芋艿、豆类、瓜类、茄、辣椒、番茄、甘薯、棉花、大豆、玉米和烟草等90种植物。斜纹夜蛾对农业的危害具有较强的隐蔽性和突然暴发性的特点。一旦爆发，可使农作物平均减产20%～40%，严重者减产60%，给农业生产带来巨大经济损失[7-9]。据FAO报告，病虫害导致全球每年240～480亿美元的损失，其中斜纹夜蛾为主要农业害虫之一。目前，生产中常用有机氯、有机磷、氨基甲酸脂类和拟除虫菊酯类等化学杀虫剂控制害虫。但是，化学农药降解困难，存在潜在的环境风险。因此，从植物中寻找对抗斜纹夜蛾危害的防治方法，是目前农业病虫害防治的重要途径。从化学生态学的角度出发，以赪桐挥发性成分为研究对象，通过GC-MS联用的方法对其挥发性成分进行研究，找寻其中的化学防御物质基础，并采用浸虫、浸叶法研究其对斜纹夜蛾幼虫的杀虫活性，验证其化学防御的可能性，为后续生物农药的研发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物样品 采自贵州省独山县，经昆明植分生物技术有限公司鉴定为马鞭草科大青属植物赪桐〔C.japonicum(Thunb.) Sweet〕。标本存放于贵州民族大学天然药物化学实验室(标本编号：KMZFC20190708-2)。

1.1.2 试剂 60～90℃石油醚(AR)，成都市科隆化学品有限公司；吐温-80(CP)，成都金山化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器设备 HWS-250B恒温恒湿培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；AKRY-UP-1816超纯水机，成都艾柯水处理有限公司；YC-D205超声波加湿器，北京亚都环保科技有限公司；500 mL烧杯，四川蜀玻有限责任公司；HP6890/5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.1.4 其他 斜纹夜蛾虫卵，购自济源科云生物有限公司；白菜，购自贵州医科大学绿谷超市。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

1) 供试药液制备。赪桐地上部分粉碎，准确称取赪桐粗粉50 g，加入石油醚350 mL，温度60℃，热回流提取3次，每次1 h。提取液浓缩得墨绿色、具有特殊气味的提取物0.924 g。以上过程重复提取8次，共得浸膏7.392 g。精确称量赪桐石油醚提取物800 mg、600 mg、400 mg、200 mg、100 mg、50 mg及25 mg，分别置于10 mL容量瓶，加入5%吐温-80水溶液至容量瓶刻度，配制成浓度为80.0 mg/mL、60.0 mg/mL、40.0 mg/mL、20.0 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL和2.5 mg/mL的供试药液，震荡摇匀后备用。以5%吐温-80水溶液和纯水作空白对照。

2) 斜纹夜蛾饲养。参照杜鹃[10]的方法饲养斜纹夜蛾幼虫。在500 mL烧杯中放入洗净晾干的白菜叶，将斜纹夜蛾虫卵置于其上，于相对湿度40%，光照L∶D为16∶8，温度27℃的恒温恒湿培养箱中饲养。待幼虫孵出后保持温度不变，每48 h定时更换菜叶，同时用软毛刷将幼虫转移至新鲜菜叶上。幼虫蜕皮1次为1日龄，幼虫达3日龄时挑选810只健康、大小相同的斜纹夜蛾幼虫，每30只1组，备用。

1.2.2 试验设计

1) 石油醚提取物化学成分的GC-MS分析。采用GC-MS分析石油醚提取物的化学成分。GC条件：FLM FB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，柱温46℃，保留2 min，以8℃/min升温至118℃，再以6℃/min升温至310℃，保留11 min，运行54 min；汽化室温度250℃；载气为He；柱前压7.41 Psi，流量1.0 mL/min；分流进样；溶剂延迟4 min。MS条件：EI源，离子源温度230℃，电子能量70 eV，接口温度280℃，质量范围29～500 amu。

2) 赪桐石油醚提取物对斜纹夜蛾的杀虫活性。根据处理浓度试验设9个处理，依次为80.0 mg/mL、60.0 mg/mL、40.0 mg/mL、20.0 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL和2.5 mg/mL，以及5%吐温-80水溶液(CK1)和纯水(CK2)。将菜叶去梗洗净晾干，剪成5 cm×5 cm的小片备用。采用浸虫浸叶法[11]，将叶片分别放入各处理溶液中浸泡20 s，取出晾干后分别置于烧杯中并编号，每个烧杯中放入菜叶6片；再将每组幼虫分别在各处理溶液中浸泡5 s后取出，放入对应的放有菜叶的烧杯中，每个杯中放10只。3次重复，共27组。处理后的幼虫放入相对湿度40%，光照L∶D为16∶8，温度27℃的恒温恒湿培养箱中培养，每24 h观察1次并记录幼虫死亡数据，观察至72 h结束。用棉签轻轻拨动其尾部，有反应的判断为活，无反应或干瘪的判断为死亡。根据死亡数量计算其死亡率。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010和SPSS 21.0统计数据并计算半数致死浓度LC50值[12]。

2 结果与分析

2.1 赪桐石油醚提取物的化学成分

通过GC-MS分析获得赪桐石油醚提取样品的总离子流(图1)经计算机质谱系统检索并核对Nist2014和Wiley275标准质谱后确定，赪桐石油醚提取样品中共含有21种挥发性成分；经峰面积归一化法测定21种挥发性化合物的相对质量分数，占总提取物的71.347%。从表1看出，赪桐石油醚提取物的化合物类型有脂肪族、萜类和芳香族，脂肪族和萜类是其主要组成部分，脂肪族化合物17种，占石油醚提取物总种数的56.967%，其中，主要有油酸、亚麻酸甲酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、新植二烯和六氢法尼基丙酮等，其相对含量分别为37.974%、6.868%、4.661%、3.727%、1.379%和1.008%；萜类化合物3种，占石油醚提取物总种数的11.763%，分别为叶绿醇、芳樟醇和二氢猕猴桃内酯，其相对含量为10.506%、0.990%和0.267%；芳香族化合物1种，占石油醚提取物总种数的2.617%，为维生素E，其相对含量为2.617%。

表1 赪桐全草石油醚提取物成分及相对百分含量

表2 不同浓度赪桐石油醚提取物浸虫浸叶处理斜纹夜蛾幼虫的死亡率

2.2 赪桐石油醚提取物对斜纹夜蛾的杀虫活性

由表2可知，不同浓度赪桐石油醚提取物浸虫浸叶处理斜纹夜蛾幼虫24 h、48 h及72 h死亡率。赪桐石油醚提取物浓度为80.0 mg/mL、60.0 mg/mL和40.0 mg/mL时，表现出较强的杀虫活性，在处理72 h时死亡率最高达98.9%，最低为92.2%；大部分幼虫在处理24 h内死亡。当浓度为20.0 mg/mL、10.0 mg/mL和5.0 mg/mL时，24 h时死亡率分别为72.2%、53.3%和32.2%；浓度为10.0 mg/mL时，72 h内对斜纹夜蛾的杀灭效果为54.4%。浓度为2.5 mg/mL时，72 h内的杀灭活性较弱，死亡率仅15.6%，不及5%吐温-80水溶液(CK1)的杀灭效果。表明，赪桐石油醚提取物在抗斜纹夜蛾幼虫生物活性方面具有较好的量效关系。经拟合得赪桐石油醚提取物对斜纹夜蛾3日龄幼虫的毒力回归方程：Y=-2.739+2.494X(R2=4.230，P=0.517)，半数致死浓度为12.534 mg/mL，95%置信区间为10.405～14.719 mg/mL。

3 结论与讨论

研究表明，采用GC-MS分析、鉴定出赪桐石油醚提取物的化学成分主要有油酸、亚麻酸甲酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、新植二烯、六氢法尼基丙酮、叶绿醇及维生素E等21种挥发性化合物，分属脂肪族、萜类和芳香族，占总提取物的71.347%；赪桐石油醚提取物对斜纹夜蛾幼虫具有较强的杀虫生物活性(LC50为12.534 mg/mL)。有研究报道，棕榈酸甲酯可避免苹果蠹蛾(Cydiapomonella)和葡萄小卷蛾(Lobesiabotrana)过度密集的产卵和重复性产卵[13-14]。黄蜂通过喷出棕榈酸甲酯防止蚂蚁袭击[15]。棕榈酸甲酯对朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)具有触杀作用，与表面活性剂Silwet L-77混合后能提高其杀螨效果[16]。芳樟醇为链状萜烯醇类化合物，具有抗菌、抗病毒、镇静、驱虫和杀虫等生物活性[17]，对菜青虫(Pierisrapae)产生显著的拒食作用[18]。芳樟醇能毒杀和熏杀荔枝蒂蛀虫(Conopomorphasinensis)的蛹、虫卵及成虫，杀灭作用随浓度提高而增强，对荔枝蒂蛀虫虫卵的孵化和蛹的羽化过程具有一定的抑制作用[19]。六氢法尼基丙酮有驱蚊虫作用[20]。表明，上述化合物具有一定的杀虫活性，可能一定程度上代表赪桐石油醚部位的杀虫活性，但其对斜纹夜蛾幼虫具体的抗生物活性，还需要进一步验证。该研究为后续赪桐挥发性杀虫成分的探讨奠定了基础。然而，该研究中挥发性化学成分被检出较少，可能由于其挥发油中新化学成分较多亦或相关化合物未被已有的质谱数据库收录。同时，该提取物中是否还存在其他杀虫生物活性成分，还有待进一步研究。