影响检测生活饮用水中菌落总数的相关因素探讨

张 席

上海工微所科技有限公司， 上海 200233

细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，长期以来，国内多采用异养菌平板计数法[1,2]来测定水中的活菌数，现今对生活饮用水中的菌落总数检测主要是根据《生活饮用水标准检验方法 微生物指标(GB/T 5750.12—2006)》中的平板计数法[3]来做，但由于饮用水中的贫营养环境有别于传统培养基提供的富营养环境，大多数在显微镜下观察到的细菌不能在传统培养基中生长，致使活菌计数结果偏低。吖啶橙染色直接计数、活菌直接计数等方法可快速提高饮用水中的活菌计数[4]，但这些方法要求高，需配备昂贵的仪器设备及专业技术人员。大部分小实验室还是会选择比较简单的平板计数法，所以提高现有平板计数法的活菌检出率是很有必要。

GB/T 5750.12—2006检测水中菌落总数使用营养琼脂(36±1) ℃培养48 h，而《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定(GB 4789.2—2016)》中菌落总数检测[5]采用平板计数琼脂，并规定一般食品为(36±1) ℃培养(48±2)h，水产品是在(30±1) ℃培养(72±3) h，这是因水产品在温度较低的水底生长，兼受海洋细菌与陆地细菌的污染，故以30 ℃作为培养温度[6]。

本文将通过培养基的种类、培养温度、实验操作方法等条件和方法的比较，探讨影响水中菌落总数检测结果的影响因素，筛选合适的检测参数，采用营养修复和实样统计分析等手段研究缩短检测时间的可能性，以提高平板计数法的检出率的同时减少检测时间，为GB/T 5750.12—2006中菌落总数检测方法的改进提供数据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

培养箱(型号LRH-250，上海齐欣科学仪器有限公司);灭菌锅(型号LDZX-50FBS，上海申安医疗器械厂);水浴锅(型号DK-S28，上海精宏实验设备有限公司);显微镜(型号BX-53，奥林巴斯) ;温度计(型号0-100℃，上海华辰医用仪表有限公司);气浴恒温振荡器(型号THZ-82A，金坛市万华实验仪器厂);光学放大菌落计数器(型号 YLN-30，北京市亚力恩科学器材公司)。

1.2 供试培养基及样品

葡萄糖(批号20180403，江苏强盛功能化学股份有限公司);营养琼脂(批号20190102，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司);平板计数琼脂(批号20191127，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司);脑心浸液肉汤(批号20180726，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司);硫代硫酸钠(批号20181101，无锡市亚泰联合化工有限公司);样品：生活饮用水(由某食品加工生产企业送检提供或实验室自备)。

1.3 实验方法

1.3.1两种培养基在不同培养条件下对菌落总数检测结果的影响比较

在每125 mL生活饮用水样品中加入0.1 mL的1%硫代硫酸钠灭菌溶液进行除氯，振荡摇匀后立即吸取1 mL分别置于8块无菌平皿中，其中4块倒入营养琼脂培养基，另外4块倒入平板计数琼脂培养基，待凝固后每种培养基的其中2块置于36 ℃培养2 d～10 d，另2块置于30 ℃培养2 d～10 d，分别观察结果。同时平行三次试验，取其平均值来比较分析。

1.3.2添加不同比例的葡萄糖对检测结果的影响比较

在营养琼脂培养基中各加入0.0%、0.1%、0.3%、0.6%和1%的葡萄糖；在平板计数琼脂培养基中加入0.0%、0.2%、0.5%和0.9%的葡萄糖，使两种培养基中葡萄糖含量保持一致，将样品除氯后，吸取1 mL分别置于36块无菌平皿中，分别倒入这两种含有不同比例葡萄糖的培养基，待平板凝固冷却后分别置于36 ℃和30 ℃培养2 d～10 d。

1.3.3涂布平板法与倒平板法对检测结果的影响比较

5个样品除氯、摇匀后，分别吸取0.5 mL置于4块无菌平皿中，其中2块倒入(45±1) ℃平板计数琼脂培养基，另外2块倒入(40±1) ℃平板计数琼脂培养基，同时置于30 ℃培养2 d～10 d。同时，分别吸取0.5 mL置于2块已倾注好平板计数琼脂的无菌平皿中，用涂布法将样品涂布均匀后，置于30 ℃培养2 d～10 d。

涂布的无菌平皿应提前制备，平板计数琼脂倾注到无菌平皿中后做去水汽处理，避免涂布后细菌混在一起无法计数。本实验所用无菌平皿，是当天倾注好后打开平皿盖子，放置在生物安全柜内通风2 h～4 h后，取出备用。

1.3.4营养修复后再培养对检测结果的影响

加强充足的营养环境来复苏或修复[7]细胞，可能会提高生活饮用水中的活菌检出率。批量样品除氯后，按样品: 脑心浸液肉汤(BHI)为1∶1、1∶5、5∶1、1∶10和10∶1的量加入BHI液体培养基中，25 ℃下分别修复培养0 h、2 h、4 h和6 h后，平板计数琼脂30 ℃培养2 d～7 d，计数，分析营养修复对计数的影响。

1.3.5按改进后方法对批量样品检测结果的统计分析

采用改进后的方法，即平板计数琼脂、涂布平板、30 ℃、培养7 d，对自备的实验室自来水管道用水20个、企业送检的水样42个进行检测，记录培养2 d、3 d和7 d时的计数。用SPSS 17.0对计数进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 两种培养基不同培养条件的计数比较

采用营养琼脂和平板计数琼脂在30 ℃、36 ℃下培养2 d～10 d后的计数结果见图1，可看出，GB/T 5750.12—2006中使用营养琼脂(36±1) ℃培养48 h(2 d)的数据明显较低；相同培养温度和培养时间下，平板计数琼脂上生长的菌落总数明显高于营养琼脂培养的实验结果；从第3 d开始，30 ℃条件下的菌落总数明显高于36 ℃培养的结果，说明平板计数琼脂培养基、30 ℃更适合生活饮用水中菌落总数的生长。

图1 两种培养基分别在36 ℃、30 ℃培养2 d～10 d的菌落总数

表1 平板计数琼脂在30 ℃培养2 d～10 d的菌落数日增长率及与10 d计数的比值

表1是平板计数琼脂在30 ℃下培养2 d～10 d的菌落计数的每日增长率及其与10 d计数的比值。结果发现，平板计数琼脂30 ℃培养2 d后，在培养基上形成的肉眼可见的菌落，仅占10 d可见菌落的11.2% 左右，3 d后提高至40.8%，3 d的增长率达到了263.6%，而后开始逐步下降，直到6 d还有19.4%以上的增长率，从7 d开始增长率下降至7.0%以下，说明水中细菌总数在2 d～6 d增长幅度很大。对2 d～9 d与10 d成对实验数据平均数进行t检验[8]，2 d～6 d与10 d的实验结果有显著差异，而7 d～9 d与10 d实验结果没有显著差异。说明水中菌落总数在平板计数琼脂中、30 ℃条件下需要培养7 d才能达到生长峰值。

2.2 添加不同比例葡萄糖对计数结果影响的比较

比较平板计数琼脂和营养琼脂两种培养基的配方成分，发现前者比后者多0.1%的葡萄糖。平板计数琼脂更适合水中菌落总数生长是否是因为多了葡萄糖，因此，在两种培养基中添加不同比例的葡萄糖，研究葡萄糖对计数的影响。

图2是两种培养基添加不同比例的葡萄糖后在36 ℃、30 ℃下培养2 d～10 d的计数结果。可以看到，在同一种培养基中，30 ℃培养结果明显高于36 ℃培养结果，与图1显示的结果一致；添加葡萄糖后的营养琼脂，36 ℃下培养的检出数有少量提高，30 ℃下的培养结果反而降低；添加葡萄糖后的平板计数琼脂培养基，两个培养温度下的检出率均没提高，说明原有的0.1%葡萄糖已能满足微生物生长的需要。

2.3 倒平板法与涂布平板法对检测结果的影响比较

表2是涂布平板法与倒平板法对检测水中菌落总数的影响比较。发现两个方法在2 d～6 d菌落总数累积增长率都在700%以上，说明在2 d～6 d菌落总数呈大幅生长趋势，7 d～10 d累积增长率只有18.0% 以下，说明生长开始趋于平稳；倒平板法在30 ℃培养2 d后，在培养基上形成肉眼可见的菌落仅占10 d可见菌落的5.6%～6.4%，3 d后约占10 d平板上菌落总数的23.9%～25.4%；用涂布平板法在30 ℃培养2 d后，在培养基上形成肉眼可见的菌落仅占10 d可见菌落的8.6%左右，3 d后约占10 d平板上菌落总数的30.3%，说明两种方法相差不大，涂布平板法没有显著提高检出率。

倒入(40±1) ℃、(45±1) ℃两种温度的培养基经10 d培养后的计数结果无显著性差异，说明倒入40 ℃～45 ℃的培养基对水中微生物的影响不大。通过2 d～9 d与10 d成对实验数据平均数比较t检验[8]，2 d～6 d与10 d检测结果有明显的差异，7 d～9 d与10 d实验结果都没有显著差异。从图3中也可明显看出涂布平板法与倒平板法检测菌落总数结果无差异性。

图4是涂布平板法与倒平板法在30 ℃培养3 d的照片，可看出，涂布平板比倒平板上的生长菌落明显大，计数方便。倒平板法在倾注培养基时要控制好培养基的温度，避免温度太高杀死部分不耐热细菌致使计数偏低，或温度太低无法与样品均匀混合使细菌生长不均等问题[9]，涂布平板是提前配制，不存在这些影响因素。因此确定水中菌落总数的检测采用平板计数琼脂、涂布平板、30 ℃培养7 d的方法。

图2 两种培养基添加不同比例葡萄糖后在36 ℃、30 ℃培养2 d～10 d的计数结果

表2 涂布平板法与倒平板法对水中菌落总数检测的影响比较

图3 涂布平板法与倒平板法用平板计数琼脂30 ℃培养2 d～10 d的计数结果

图4 涂布平板法(左)与倒平板法(右)30 ℃培养 3 d的照片

2.4 营养修复后再培养对检测计数的影响

改进后的生活饮用水中菌落总数的检测方法已确定，但该方法需培养7 d，时间较长。一般生活饮用水中的营养贫乏，而还有含氯的抑菌物质存在，对水中的微生物细胞都会有影响，通过镜检观察到有芽孢菌存在，说明有细胞受损等情况，所以水中微生物生长缓慢，需要较长的培养时间。通过加强充足的营养环境来复苏修复受损的细胞，可能可以加快细胞生长，缩短培养时间。

批量样品经营养修复实验后，发现水样中微生物主要有两种类型，A类是营养修复后对其活菌生长速率没影响；B类是自身能正常生长，营养修复后，生长速率加快。

A类样品，除氯后在25 ℃条件中增加不同浓度的营养物质BHI修复0 h～6 h，结果均没有出现增殖现象，在较高营养物质浓度中出现随着修复时间加长而生长下降的趋势，增加营养对细胞修复有限，不能提高活菌生长速率，见图5。

B类样品，除氯后在25 ℃环境条件中修复0 h～6 h，随着修复时间的增加，样品原液(1∶0)和不同修复营养浓度下的样品的菌落总数均出现大幅度增殖，见图6，说明此类细菌易生长，无需修复。如图7所示，B类样品经修复后，在30 ℃下培养2 d、3 d和7 d的检测结果无明显差别，说明B类样品只需培养2 d～3 d就能达到最高峰值。

图5 A类样品经在不同修复营养浓度中25 ℃修复0 h～6 h后检测结果

图6 B类样品经在不同修复营养浓度中25 ℃修复0 h～6 h后检测结果

从图8、图9中看出，两类水样中的菌落形态不一样，A类水样菌落形态为灰白色、暗黄色、橘红色为主要菌落，而B类水样生长在平板计数琼脂表面的是比较大且较粘稠的乳白色菌落、表层里的为乳白色细小菌落。

进一步镜检结果见图10。A类水样检测平板上的三种细菌分别为以弧菌、长杆菌与短杆菌，并有少量芽孢菌存在，如图10-1、10-2、10-3所示。有芽孢菌说明水中的部分细菌由于各种原因受抑制、损伤而在短时间内尚未形成肉眼可见的菌落，需继续培养后使其复苏并繁殖形成菌落[10]，培养刚开始2 d形成的菌落比较少，此类菌生长缓慢需培养7 d。而B类水样检测平板上的两种看似大小不一的细菌，经镜检发现都是球菌，见图10-4，说明B类水样生长的菌，在需氧条件下生长比厌氧条件下生长形成的菌落更快速，总的来说，此类细菌是一种容易生长的优势菌，培养2 d～3 d即可。

图8 A类样品修复0 h～6 h后培养7 d的照片(从上右顺时针0 h、2 h、4 h和6 h)

图9 B类样品的0 h～6 h后培养7 d的照片(从上右顺时针0 h、2 h、4 h和6 h)

因此加强充足的营养物质，只会让某类易生长的优势菌大幅生长，没能让所有细菌达到同步生长繁殖，反而出现增殖或减少，影响检测结果，故生活饮用水中菌落总数的检测不宜采用营养修复方式进行预处理，一般水样收到后应尽快开始检验，以尽量减少细菌群的变化，零星送检的瓶装采样，若未经冷却，采样后6 h之内应行检验[11]。

2.5 按改进后方法对批量样品检测结果的统计分析

按改进后方法对62个水样进行检测，记录培养2 d、3 d和7 d时的计数结果，发现7 d计数与2 d和3 d计数有一定的关系，采用SPSS 17.0对这些数据进行线性回归拟合。

62个水样中有7个样品(占比11.3%)，3 d与2 d计数的比值<2，7 d检测结果与3 d计数接近，拟合后得线性回归方程(1)：Y=-0.387+1.155X(R=0.989)，其中Y为7 d检测结果，X为3 d计数。这类样品的菌落易生长且单一，培养2 d～3 d就达到生长峰值，与B类水样相似。

另外55个样品(占比88.7%)，3 d与2 d计数的比值≥2，3 d时计数与7 d时检测结果有显著性差异，培养2 d时菌落较少，3 d时生长速率加快，7 d时达到生长高峰，与A类水样的特征比较相似，生长缓慢且有色素菌，需培养7 d后才能达到峰值。对这55个样品7 d检测结果和3 d计数进行拟合，得线性回归方程(2)：Y=27.455+2.525X(R=0.928)，其中Y为7 d检测结果，X为3 d计数。

改进后的方法需要培养7 d才能得到检测结果，但经过以上统计分析，可根据培养2 d、3 d计数以及相应的回归方程，预测7 d计数，从而预判样品的检测结果。

3 结 论

参考GB 4789.2—2016，对生活饮用水中菌落总数的检测方法进行了改进，发现GB/T 5750.12—2006中使用营养琼脂(36±1) ℃培养2 d的计数结果偏低，采用平板计数琼脂培养基、30 ℃下培养2 d时，计数结果达到生长最高峰值的0%～11.2%，培养3 d计数结果能达到32.6%～40.8%，培养7 d达到生长最高峰值。

涂布平板法与倒平板法的计数结果无明显差异，但涂布平板法在相同培养时间下菌落形态更大，更易于计数。

营养修复实验发现水样中的菌落有两种类型，A类特点是生长缓慢且有多种色素菌，需培养7 d才能达到峰值；B类特点是易生长且单一，培养2 d～3 d即可。营养修复不能加快菌落总数的检测时间，不建议对水样进行营养修复前处理，应立即检测。

采用平板计数琼脂培养基30 ℃培养7 d的方法检测水样的菌落总数，可根据培养3 d与2 d时计数的比值以及相应的回归方程，预测7 d时的计数结果。当样品培养3 d与2 d计数的比值<2时，7 d 检测结果Y=-0.387+1.155X(R=0.989，X为3 d计数)；当培养3 d与2 d计数的比值≥2时，7 d检测结果Y=27.455+2.525X(R=0.928，X为3 d计数)。

今后生活饮用水中菌落总数测定标准GB/T 5750.12—2006的改版，可参照国标GB4789.2—2016中的水产品要求，用平板计数琼脂30 ℃培养3 d～7 d，这样更能接近反映水中菌落总数的真实数值。另外，采用改进后方法计数时有相当比例的计数结果大于100 CFU/mL，故建议对现有生活饮用水的菌落总数判定限值进行合理的修订。