耶氏肺孢子菌不同病原学染色形态特征在PJP诊断中的效果评价*

薛 婷，王淑峰，杜伟勤，卢 鸿，张新日△

山西医科大学第一医院：1.呼吸与危重症医学科；2.检验科，山西太原 030001；3.山西省吕梁市人民医院医学检验科，山西吕梁 033000

肺孢子菌是一种机会致病性真菌，具有显著的宿主特异性，感染人的肺孢子菌是耶氏肺孢子菌(P.jirovecii)，可引起严重且致命的肺孢子菌肺炎(PJP)[1]。近年来，随着高效抗反转录病毒治疗的开展与应用，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人群中PJP的发病率明显下降，但非HIV感染人群，如器官移植受者、进行放化疗的恶性肿瘤和自身免疫性疾病患者的PJP发病率逐年增高[2-4]，且P.jirovecii定植的现象在呼吸系统疾病患者中非常普遍。P.jirovecii缺乏有效的体外培养体系是阻碍其致病性、病原学及流行病学研究进展的主要原因。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，诸如巢式PCR、环介导恒温扩展技术等检测P.jirovecii基因的方法日渐增多[5-8]，但均无法区分P.jirovecii定植和感染状态，而病原学染色方法仍是确诊PJP的“金标准”。因此，本研究通过比较P.jirovecii不同病原学染色的形态特征，分析其在PJP诊断中的价值，期望为PJP的早期诊断提供有效的病原学检测方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者，男，51岁，咳嗽、咳痰，伴气短、胸闷加重，于2019年11月27日入住山西医科大学第一医院呼吸与危重症医学科。实验室检测指标：二氧化碳分压30.5 mm Hg，氧分压60.8 mm Hg，淋巴细胞百分比7.5%，淋巴细胞绝对值0.5×109/L，红细胞沉降率(ESR)65 mm/h,乳酸脱氢酶(LDH)699 U/L，CD4+T细胞计数1 mm39个，CD4+T细胞/CD8+T细胞0.03，超敏C反应蛋白(hs-CRP)129.17 mg/L，白细胞介素-6 81.57 pg/mL，降钙素原(PCT)0.161 ng/mL，HIV-1抗体阳性。胸部X线片可见双肺纹理增多，局部纹理紊乱、模糊，两侧胸壁下可见条索状密度增高影。肺部CT可见双肺透亮度减低，小叶间隔增厚影及磨玻璃密度影，双肺下叶可见多发斑片状密度影，左肺下叶外基底段实性小结节影。行纤维支气管镜检查，收集肺泡灌洗液(BALF)送检，真菌荧光染色镜检可见P.jirovecii包囊。结合患者临床表现、实验室检查及影像学表现，考虑为PJP。本研究通过山西医科大学第一医院伦理委员会批准(2019-K051)，患者签署知情同意书。

1.2主要试剂 快速革兰染色液(BA4012，珠海贝索生物技术有限公司)，抗酸染色液(BA4091，珠海贝索生物技术有限公司)，Wright-Giemsa染色液(BA4017，珠海贝索生物技术有限公司)，真菌荧光染色液(19091901，青岛市三凯医学科技有限公司)，六次甲基四胺、四硼酸钠(辽宁永强医药器械化玻有限公司试剂厂)，氯化金[A602526，生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3涂片制备 收集该患者BALF，取500 μL经涂片离心机离心后，制成涂片。以临床分离培养鉴定的近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)作为对照，无菌接种环取血培养皿上的C.parapsilosis菌落配置成菌悬液，制成涂片。

1.4染色方法

1.4.1革兰染色 涂片自然干燥，染色前用酒精灯外焰加热固定。革兰染色步骤严格按说明书进行：(1)龙胆紫液染色10 s，水洗，甩干；(2)碘溶液染色10 s，水洗，甩干；(3)脱色液脱色10～20 s，水洗，甩干；(4)沙黄溶液复染10 s，水洗，自然干燥后油镜镜检。

1.4.2抗酸染色 涂片干燥、固定。抗酸染色步骤严格按说明书进行：(1)石碳酸复红溶液染色15 min，水洗，甩干；(2)酸性酒精溶液脱色至涂片无红色染料，水洗，甩干；(3)亚甲基蓝溶液复染1 min，水洗，自然干燥后油镜镜检。

1.4.3真菌荧光染色 涂片滴加1滴真菌荧光染色液，使染色液与标本充分结合，盖上盖玻片，滤纸吸取多余溢出的染色液，轻压盖玻片，荧光显微镜镜检。

1.4.4HE染色 涂片自然干燥，冰甲醇固定，HE染色步骤如下：(1)苏木精水溶液染色8 min；(2)于盐酸乙醇中分化5 s；(3)自来水冲洗30 min后用蒸馏水冲洗3 s；(4)乙醇伊红染色液染色3 min；(5)于95%和100%乙醇中各脱色5 min；(6)于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各透明5 min；(7)中性树胶封片后镜检。

1.4.5Wright-Giemsa染色 待涂片自然干燥后冰甲醇固定，滴加Wright-Giemsa A液2～3滴，染色1～2 min，滴加等量Wright-Giemsa B液(pH=6.8)，轻晃载玻片使Wright-Giemsa A、B液充分混匀，染色2 h，水洗，自然干燥后油镜镜检。

1.4.6改良Giemsa染色 待涂片自然干燥后冰甲醇固定，Giemsa 染液[pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)20倍稀释Giemsa原液]染色约2 h，双蒸水洗3次，自然干燥后油镜镜检。

1.4.7改良GMS染色 待涂片自然干燥后冰甲醇固定，改良GMS染色步骤如下：(1)过碘酸固定5 min，双蒸水洗3次，甩干；(2)载玻片置于预热的加热板上，滴加GMS工作液，覆盖涂片，加热3～5 min (此过程中避免GMS工作液干涸)，直至涂片颜色变为深褐色，待冷却后双蒸水洗3次，甩干；(3)滴加氯化金溶液，15 s后待涂片颜色变为灰白色时倾倒掉氯化金，双蒸水洗3次，甩干；(4)硫代硫酸钠固定3 min，双蒸水洗3次，自然干燥后油镜镜检。

2 结 果

如图1A和图2A所示，革兰染色和抗酸染色P.jirovecii包囊均不着色，可见透明空泡样结构。C.parapsilosis革兰染色阳性，镜检可见典型蓝紫色卵圆形孢子，见图1B；C.parapsilosis抗酸染色阴性，镜检可见蓝色卵圆形孢子，见图2B。图3为真菌荧光染色镜检结果，可见发出蓝色荧光的P.jirovecii包囊与C.parapsilosis孢子。HE染色镜检结果显示，P.jirovecii包囊囊壁不着色，呈透明晕圈状，囊内可见4～8个囊内小体，呈蓝紫色，见图4A；C.parapsilosis HE染色可见孢子呈紫红色,见图4B。图5A、5B分别为P.jirovecii包囊Wright-Giemsa染色和改良Giemsa染色镜检结果，均可见圆形或卵圆形P.jirovecii包囊，囊壁不着色但折光性强，呈新月形，囊内可见4～8个囊内小体；改良Giemsa染色囊内小体核呈蓝色，囊内容物呈蓝紫色，周围可见呈紫红色的滋养体，而Wright-Giemsa染色囊内容物和囊内小体核均被染成红色。改良Giemsa染色C.parapsilosis 孢子呈蓝色，见图5C。改良GMS染色镜检结果显示，P.jirovecii包囊囊壁为深褐色或黑色，呈特征性括弧样结构，囊内小体不着色，中间有1条黑色褶皱或中心点状深染，见图6A；C.parapsilosis孢子囊壁较厚，呈黑色或中心点状深染，见图6B。

注：A为P.jirovecii包囊不着色，呈透明空泡样结构；B为C.parapsilosis蓝紫色卵圆形孢子。

注：A为P.jirovecii包囊不着色，呈透明空泡样结构；B为C.parapsilosis蓝色卵圆形孢子。

注：A为发出蓝色荧光的P.jirovecii包囊；B为发出蓝色荧光的C.parapsilosis孢子。

注：A为P.jirovecii包囊囊壁不着色，囊内容物呈蓝紫色；B为C.parapsilosis孢子，呈紫红色。

注：A为Wright-Giemsa染色，P.jirovecii囊内容物和囊内小体核均被染成红色；B为改良Giemsa染色，P.jirovecii囊内小体核呈蓝色，囊内容物呈蓝紫色，周围可见呈紫红色的滋养体；C为改良Giemsa染色，C.parapsilosis孢子呈蓝色。

注：A为P.jirovecii包囊囊壁为深褐色或黑色；B为C.parapsilosis孢子囊壁较厚，呈黑色或中心点状深染。

3 讨 论

P.jirovecii缺乏可靠的体外培养体系，且临床实验室缺乏诊断PJP的有效方法和经验，加之痰液中P.jirovecii的检出率较低，因此P.jirovecii感染易被临床漏诊。

P.jirovecii作为一种非典型真菌，革兰染色、抗酸染色的染色效果差。本研究发现，若BALF涂片在经革兰染色和抗酸染色发现有空泡样结构，应高度怀疑P.jirovecii感染，并进一步经真菌荧光染色初步判定。真菌荧光染色是一种快速检测真菌感染的染色方法，其染色液中的荧光染料与真菌细胞壁成分结合，在紫外光激发下呈强荧光，通过荧光显微镜可观察真菌形态。该方法方便快捷，灵敏度高，在荧光显微镜下真菌形态清晰，可提高检出率，且对检验人员技术要求较低，便于临床快速诊断。虽然真菌荧光染色适用范围广，但检测P.jirovecii的特异度较差，本研究运用其分别对P.jirovecii和C.parapsilosis染色，荧光显微镜镜检结果显示，二者孢子呈现的荧光形态相似，容易混淆，因此真菌荧光染色对于P.jirovecii的检测特异度较低。

HE染色是病理组织石蜡切片最常用的染色方法，本研究对BALF涂片中P.jirovecii 包囊使用HE染色，结果显示，P.jirovecii包囊囊壁不着色，呈透明晕圈状，囊内可见4～8个囊内小体，呈蓝紫色，与鲁怀伟等[9]的染色结果一致。Wright-Giemsa染色是血液细胞学染色最常用的方法；改良Giemsa染色常用于细胞核和寄生虫的染色。本研究对BALF涂片中P.jirovecii包囊分别使用Wright-Giemsa和改良Giemsa染色，镜检结果显示，两种染色方法的染色背景有所区别，包囊结构特征与HE染色相似，均呈现P.jirovecii包囊的典型形态学结构，即囊壁不着色，囊内可见4～8个囊内小体；Wright-Giemsa和改良Giemsa染色中P.jirovecii包囊囊壁不着色，易与其他真菌鉴别。但Wright-Giemsa染色可使BALF中细胞、黏液等其他物质着色，且PBS的pH值对细胞染色有很大影响，致使P.jirovecii包囊结构与背景中其他成分缺乏对比，难以区分；改良Giemsa染色对PBS的pH值进行了调整，可见P.jirovecii滋养体，较Wright-Giemsa染色检出率高。本研究运用改良GMS染色检测P.jirovecii与C.parapsilosis，结果表明，尽管二者均着色，且均有中心点状深染形态结构，但C.parapsilosis孢子囊壁较厚，大小、形态均与P.jirovecii典型包囊有显著区别。改良GMS染色可使其他真菌的菌丝、芽孢等结构着色，但根据孢子大小、形态及孢子囊壁的厚薄均能与P.jirovecii典型包囊结构鉴别。

此外，当患者高度怀疑PJP，但经病原学染色未找到P.jirovecii典型形态结构，或因无法耐受支气管肺泡灌洗致使无法获得BALF标本时，应结合患者CD4+T细胞计数、血清LDH等实验室指标进行判断。P.jirovecii感染与CD4+T细胞的反应密切相关，CD4+T细胞计数在判断艾滋病患者免疫系统抑制程度、PJP疾病进展及临床诊疗方面具有重要的指导意义[10-11]。血清LDH有助于PJP的辅助诊断，还可动态反映病情的进展和疗效[12-13]。本研究中患者血清LDH水平增高，CD4+T细胞计数降低。此外，本研究中患者PCT、hs-CRP、ESR水平均增高，但这些指标缺乏特异性，因此应结合其他辅助检查及临床症状综合考虑[14]。

由于本研究应用C.parapsilosis血培养皿纯培养物配置成菌悬液，而非存在C.parapsilosis的BALF制成涂片进行不同方法染色，因此有一定局限性，即本研究涉及的不同染色方法镜检结果因缺少BALF中细胞及黏液等其他物质的染色背景，C.parapsilosis的轮廓和形态结构清晰可见，易于辨别。然而在实际检测中，大多数真菌经HE、Wright-Giemsa、改良Giemsa染色后，其颜色与细胞、组织、其他物质背景颜色接近，尤其当真菌数量不多时，更不易区分。

综上所述，BALF是检测P.jirovecii的最佳标本，当革兰染色和抗酸染色发现BALF中存在成堆排列的透明空泡样结构时，应高度怀疑P.jirovecii感染，并联合多种染色方法进一步确认。真菌荧光染色可快速检出P.jirovecii，但难以与其他酵母样真菌鉴别；HE染色、Wright-Giemsa染色、改良Giemsa染色、改良GMS染色均可用于确诊PJP，但HE染色、Wright-Giemsa染色、改良Giemsa染色中P.jirovecii包囊结构与背景中其他成分缺乏对比、难以区分，对检验人员要求较高；改良Giemsa染色易于区分P.jirovecii与其他真菌结构，可用于P.jirovecii的筛选；改良GMS染色的染色效果良好，是临床确诊PJP的推荐病原学染色方法。此外，当临床高度怀疑PJP，但病原学染色未见P.jirovecii典型结构时，可结合LDH、CD4+T细胞等检查结果及影像学表现综合判断。