山羊痘病毒检测方法分析

王裕铁

（临沭县畜牧发展促进中心，山东临沭 276700）

山羊痘在羊群中的爆发率为50～80%之间，针对易感羊群致死率可达到58%甚至75%左右。由于山羊痘病毒毒性较强，一旦感染治愈率极低，不但会对羊群品质带来重大影响，而且当妊娠期母羊染病后会出现流产等不良后果。因此，世界将其列为Ⅰ级羊群疾病，需引起养殖人员的高度重视。

1 山羊痘病毒的特性

山羊痘病毒作为羊痘病毒属的一种类型，它的毒素较强，且致死率较高，尤其在羔羊感染中可达到100%死亡率。山羊痘病毒对干燥气候有着突出的耐受力，在羊群结痂皮肤内病毒仍可维持长达6个月毒性。而在高温100℃情况下，山羊痘病毒也会在5min后失活。即使在日常防治过程中对其施用500ml/L浓度的酒精或者0.1g/L高锰酸钾消毒剂，也需要确保消毒时间超过1h，否则不能有效消灭病毒。同时，对于感染山羊痘病毒的羊群，因其潜伏期最长可达到8d，故而无法起到及时预防的作用。通常在感染山羊痘病毒后，会出现1cm或1.5cm大小的圆状红斑，最终形成白色丘疹，对羊群健康造成极大危害。基于此，深入研究山羊痘病毒检测方法具有较强的实践意义。

2 山羊痘病毒的检测方法

2.1 聚合酶检测法

聚合酶检测法是最为常见的山羊痘检测法。相比之下具有较强的检测敏感性与特异性。实际上聚合酶检测法是通过体外酶促合成DNA的方法对山羊痘病毒加以检测。

首先，在应用聚合酶检测法对山羊痘病毒进行检测时应保持在一个不存在DNA污染环境下的专业PCR实验室里进行操作。

其次，需准确提取山羊痘病毒DNA，并设计引物。一般需保证引物长度处于15bp到30bp范围内，为了达到最佳检测目的，还需把引物浓度控制在0.00025pM/ml。

最后，还应规范检测流程，比如现将山羊痘病毒混合液进行离心处置，将其放在PCR检测仪器上实现有效扩增。具体方法是现将其置于93℃之下约3min或5min，然后再以35次左右循环次数为标准对山羊痘病毒实施40s的93℃、30s的58℃、60s的72℃温度处理手段，最终在72℃环境下进行7min保温，从中可得出检测结果。

2.2 反向间接血凝检测法

反向间接血凝检测法（RPHA）在具体检测环节应按照以下步骤进行：

（1）提取病毒，应对山羊痘病毒感染体出现病变细胞时进行采集，并在病变率达到75%时及时将其收集起来，当成检测对照组样品。

（2）制备抗原，可在山羊睾丸细胞上提取40ml山羊痘病毒培养液，并在转速6000r/min、温度4℃的条件下进行长达30min的离心处置。待1d后利用酸碱值为7.2，且浓度为0.01mol/L的无菌洗脱液（含PBS）对其加以洗脱，经过紫外光度计测器最终可分析出山羊痘病毒中含有的蛋白含量，并以此作为抗原制备基础。

（3）分离血清，可提取20ml血清，并利用H8N2S水溶液进行盐析，由此在山羊痘活疫苗皮下分离出血清。从相关实验数据中可知：RPHA法能够达到80%左右的检测效果，且灵敏度较高。因此，可将其作为一种易于操作的有效检测方法。

2.3 双重聚合酶检测法

双重聚合酶检测法相比聚合酶检测法经济性更强，且检测效果更好。通常在应用双重聚合酶检测法时具体可从荧光染料法与水解探针法展开深度研究。其中荧光染料法是将燃料与山羊DNA进行双链结合，并在光源照射下形成荧光信号，当山羊痘病毒扩增产物越多时所形成的荧光反应强度就越大，由此得出可靠的病毒检测结果。而在水解探针法中，是利用热稳定性DNA聚合酶作为检测基础，由于它具有外切酶活性，针对DNA序列中核苷酸有着良好的裂解效果。因此，可妥善解决荧光染料法中存在的非特异性问题，进而达到最佳检测目的。在双重聚合酶检测的检测过程中，若用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，可得出山羊痘病毒检测浓度为0.0283ng/ml。

2.4 DNA分子生物检测法

山羊痘病毒检测是防治山羊痘最重要的部分。以往在山羊发病时，会借助血清学常规检测法对其进行检测，但这样会遭受抗体交叉风险，从而影响检测结果的准确性。另外，还有部分地区利用电镜观察法对山羊痘病毒特性进行检测，可因其设备价格过于昂贵，导致普及率不高。在此基础上，DNA分子生物检测法是快速检测山羊痘病毒特异性与敏感性最有效的方法。它具体是在组织培养液中获取山羊痘病毒DNA片段，并在酶切分析手段的辅助下实现精准检测山羊痘病毒，从而为有关人员研究山羊痘治愈药物提供重要依据。同时，还可利用DNA分子生物检测法对已感染发病的山羊或已病死的山羊体内残留的山羊痘病毒进行检测，由此得出在防治山羊痘时应重点弱化其毒性。

3 结论

综上所述，我国对山羊痘病毒检测工作一直予以高度重视。就目前发展趋势来看，最为主要的检测方法包括聚合酶检测法、反向间接血凝检测法、DNA分析生物检测法等。为了取得更大的检测成果，应在现有基础上加大研发力度。