重症侵袭性肺曲霉病的诊断新进展

0 引言

侵袭性肺曲霉病（Invasive pulmonary aspergillosis,IPA）是一种真菌病，通常由烟曲霉菌引起，烟曲霉是一种腐生和普遍存在空气传播的真菌，其病的发生不仅取决于曲霉菌的数量和毒力，还取决于宿主的免疫状态和肺部的基础疾病[1]，重症侵袭性肺曲霉病（Severe Invasive Pulmonary Aspergillosis, SIPA）亦是如此。2017年全球估计表明，每年约有25万例患者发生曲霉病（Aspergillosis，IA）[2]，且IA与高死亡率相关，那些在体内得到诊断的患者中，死亡率从30%到50%不等[3]。此外，从医院死亡中进行常规尸检的机构表明，大约50%的IA患者仅在死后才被发现[4]。重要的是，早期开始适当的抗真菌治疗可以显著改善IA的结果[5]。可见早期诊断可明显改善患者预后。现就对SIPA的诊断新进展作一综述。

1 影像学

胸部CT扫描是诊断SIPA的首选成像方式。IPA的放射学类型主要包括4种侵袭方式[6]：血管侵袭型、气道侵袭型、混合侵袭、未定型侵袭，血管侵袭的影像学包括晕轮征、梗死状结节、内部低衰减、空洞、新月征、大结节；气道侵袭型的影像学包括小气道病变、支气管周围实变、支气管扩张或壁增厚；混合侵袭的影像学符合血管侵袭和气道侵袭；未定型侵袭的影像学不满足上述任何一种情况。典型地，在中性粒细胞减少的患者中，IPA表现为周围有磨玻璃浸润的肺结节(称为“晕轮征”)，这些结节可能会空化并产生“空气新月征”。尽管是IPA在影像学上的典型征象，但“晕轮征”和“空气新月征”均出现在不到10%的中性粒细胞减少患者[7，8]，很少出现在非中性粒细胞减少患者[7]，而其他典型的IPA放射学征象仅出现在约30%的非中性粒细胞减少患者[8]。在潜在的血液系统恶性肿瘤患者中，CT肺血管造影(CTPA)通过显示血管闭塞征象，比传统的胸部CT成像更敏感和特异地诊断血管侵袭性IPA，但与传统CT相比对IPA的其他征象(晕征，反晕征)的表现尚不清楚[9-11]。将CT和正电子发射断层扫描(PET)与([18F]FDG)结合，([18F]FDG)通常用于癌症分期以评估新陈代谢活动，但在IPA中的用途有限，因为它不能区分感染病因、癌症和其他引起炎症的原因[12-13]。一种有趣的诊断IPA的新方法是抗体引导PET/磁共振成像(免疫PET/MRI)。将[64Cu]DOTA标记的单克隆抗体mJF5应用于感染烟曲霉的中性粒细胞减少症小鼠，结合PET扫描可以定位感染的肺组织，并且能够区分曲霉和细菌病原体，也可以区分曲霉诱导的炎症和无菌性炎症。用另一种单克隆抗体成像，该单克隆抗体的荧光团(DyLight650)标记的版本显示侵袭性菌丝的定位。[64Cu]DOTA标记的单克隆抗体mJF5的另一个优点是其长半衰期，这可能允许通过系列成像监测对抗真菌治疗的反应[14]。虽然临床前小鼠模型显示这种新模式的潜力，但目前尚不清楚免疫PET/MRI在免疫功能正常患者、肺外IA患者、坏死组织患者中效果如何。因此，未来对免疫PET/MRI研究是有必要的。

2 组织病理学检查

曲霉只在部分的支气管肺泡灌洗液(BALF)和痰中生长，因此，IPA的确诊仍需要病理活检。IPA的感染通常表现为出血、坏死、脓肿或肉芽肿形成等，病灶边缘可有小动脉栓塞，组织内见菌丝及孢子可明确诊断[15]。但病理学检查往往存在时间方面的滞后性，也对病变发生的部位和人群具有选择性。例如在严重急性呼吸衰竭、肺水肿、出血、感染以及血小板减少患者上就很难实施[16]。

3 病原学检查

传统的真菌病原学检查依然是SIPA诊断的基础和线索。直接显微镜可观察菌丝的形态，发现曲霉属窄，有隔膜，透明，45度锐角的菌丝分枝，分生孢子呈链状、分离或分散出现。当分生孢子是单个或成对时，它们可能类似于酵母细胞，在显微镜下，曲霉可能与其他几种丝状真菌混淆，包括鞘孢菌属和镰刀菌，因此需要通过培=养对病原体进行明确的鉴定。烟曲霉菌在24-48小时内开始在真菌培养基和绵羊血琼脂上发育，菌落呈天鹅绒状，灰蓝色-绿色菌落。虽然显微镜和培养是诊断SIPA的基石，但很多SIPA患者的培养结果都是阴性的。因此需要结合其他方法和临床大夫的经验，使得在个体中更好的诊断。

4 抗原标志物的检测

4.1 真 菌 葡 聚 糖(1-3-β-D葡 聚 糖，beta-glucuronidase，BDG)

真菌葡聚糖(1-3-β-D葡聚糖，beta-glucuronidase，BDG)是包括曲霉在内的大多数致病真菌的细胞壁成分,可作为IA的非特异性标记物。虽然BDG在辨别真菌病原种类上存在缺陷，但国际上已经将BDG纳入血液恶性肿瘤患者发生IPA临床诊断的微生物学标准之一，其诊断价值得到肯定。但在BALF-G试验诊断实体器官移植中侵袭性真菌感染的一项前瞻性多中心研究中[17]，其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为79.2%、38.5%、27.6%和86.3%，在血清中G试验的分别为79.2%、81.8%、69.2%和83.1%。因此，G试验的准确性值得商榷的，其作为早期诊断IPA在肺移植人群中的应用值得怀疑。然而，最近一项研究报道，对于小儿造血干细胞移植后IPA的诊断中，联合进行胸部CT检查和BDG检测其敏感性和特异性都高于单独应用一种检测方法[18]。由于BDG测定没有特异性，在发生侵袭性肺曲霉病的高危人群是否采用抗真菌治疗的判定中可起到提示作用。

4.2 半乳甘露聚糖实验(galactomannan，GM)

半乳甘露聚糖实验(galactomannan，GM)是曲霉细胞壁的多糖成分，通过菌丝生长和孢子/分生孢子萌发释放[19]。对于IPA患者，外周血（血清和血浆）、BALF、尿液、脑脊液或胸水中可检测到GM[20-22]。重要的是，血GM主要在中性粒细胞减少的患者作为诊断IA的标志物，这些患者表现为曲霉属的血管侵袭性生长，而气道侵袭性生长是非中性粒细胞减少患者的典型模式。这排除了大多数非中性粒细胞减少型IPA患者的血GM阳性[23-25]，BALF GM检测已经成为诊断IPA的标准。在非中性粒细胞减少和中性粒细胞减少患者中表现同样好，尽管与所有其他IA诊断测试一样，敏感性可能在有曲霉活性预防的情况下被降低[26-28]。因此有效的抗真菌治疗已经被证明可以降低GM水平，血清GM也被认为是IPA治疗分层和预后预测的一个有前途的指标[29,30]。虽然GM仍然是诊断IA最重要的检测手段，但它有着重要的局限性。由于可能出现假阳性结果，必须考虑联合用药，基础疾病，影像学表现，临床症状等因素，以正确解释GM水平。最后，结果变化因时间设置的不同而不同，这也可能导致诊断延迟[31]。

5 分子检测

从90 年代开始，各类聚合酶链反应技术就被广泛运用于检测血液中真菌脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid，DNA)。核酸检测(nucleic acid detection，NAT)的应用不仅可以提高诊断速度，其中一些测试可以在几个小时内完成，并具有高敏感性和特异性[32,34]。然而，缺点包括试剂和设备的高成本，人员有素的训练，实验室的高标准要求，样品或试剂的污染[32,33,35,36]。一些研究结果显示PCR检测劣于血清GM试验，但也有一些研究结论正好相反。近年的几项研究认为，在接受抗真菌治疗的情况下，改良的PCR法比GM试验更敏感，最近一项研究表明两种方法联合检测诊断IPA的敏感性和特异性分别为97%、97.5%，在提高敏感性的同时仍具有高的特异性[37]。但当前处理标本的技术对提高真菌检测敏感度的效果尚未明确，不同PCR技术对于真菌检测结果也不尽相同[38,39]。并且缺乏标准化的PCR操作技术，导致各类研究结果存在显著性差异。

6 LFD技术

2008年，Thornton[40]利用烟曲霉的冻干菌丝免疫小鼠，制备了一株单克隆抗体MAb JF5，它与烟曲霉菌活跃生长过程中分泌的胞外糖蛋白抗原上的蛋白表位结合，MAb用于开发免疫层析侧流装置（LFD），用于快速检测人血清中的曲霉抗原。该试验具有高度的特异性，可与曲霉属种的抗原发生反应，但与包括念珠菌在内其他真菌的抗原不会发生反应，因此，LFD的易用性为具有较高IA风险的患者提供了一个诊断平台，但目前的研究还未经大量临床样本验证，因此，LFD在临床上应用的推广还需进一步的探讨。

7 质谱分析法

真菌在感染宿主细胞的过程中会产生真菌毒素，其中最具有杀伤力的是一种被称为真菌铁载体的蛋白。基质辅助-激光解吸电离质谱分析法可以检测血液、肺组织和尿液中此种蛋白的含量，特别是在组织标本中检测这种由真菌代谢产生的物质，可减少由直接镜检得出的假阳性结果[41]。这种检测方法具有好的应用前景，但目前尚未在人群研究中的证实。

综上所述，IPA的及时诊断仍然是一大挑战。近年来，由于IPA的发病率和死亡率持续增高，因此，研究快速、精准的诊断方法势在必行。传统的组织病理学、病原学培养目前逐渐被新型分子诊断方法所替代。最近研究发现，曲霉菌素，一种具有免疫调节性质的曲霉次级代谢产物，能够在IPA患者的血清中检测到，导致某些细胞因子升高，特别是IL-8的水平升高，在IPA患者的血液和BALF中可检测到[42]。最近，高血清IL-8水平（＞300pg/mL）已显示出对IA具有高度特异性，此外，当与BALF LFD或BALF曲霉PCR结合使用时，血清IL-8对IPA也具有高度特异性。目前正在进行较大的多中心研究以验证这些发现。如果想提高诊断的敏感性及特异性，还需要更多的临床试验及探索。