肠道菌群作为结肠直肠癌生物标志物及其干预的临床意义

张雪莹， 秦环龙

（同济大学附属第十人民医院肠道微生态诊疗中心 同济大学医学院肠道疾病研究所，上海 200072）

结肠直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的恶性肿瘤之一，全球发病率位居癌症第3，死亡率位居第2。CRC的发生与多种遗传及环境因素有关，其中肠道微生态在环境因素中占重要地位。肠道内的微生物由细菌、真菌和病毒组成。这些微生物彼此相互作用并参与宿主细胞的生命活动，共同构成肠道微生态环境。越来越多的研究表明，CRC的发生、发展和预后与肠道菌群密切相关。将肠道菌群作为CRC的生物标志物有助于CRC的早期诊断与疗效预测。以肠道菌群变化特征为靶标的干预措施有望成为辅助CRC治疗的新手段。

CRC病人的肠道微生态改变

肠道微生态系统是哺乳动物体内最复杂的生态系统。人从出生开始，微生物就定植在皮肤、消化道、呼吸道、生殖道等与外界环境接触的部位，其中肠道容纳的微生物数量和种类均最多。肠道微生物绝大部分是细菌，另有少部分真菌和病毒。肠道微生物在空间上的分布特点为，从肠道近端到远端，微生物数量和多样性依次增加，十二指肠、空肠、回肠和结肠每克内容物含微生物细胞数分别约为103、104、107和1012个[1]。通常所说的肠道菌群指的是结肠中的细菌。健康人的肠道菌群由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门等组成，其中厚壁菌和拟杆菌占据优势。某些益生菌如双歧杆菌、乳杆菌等占有一定比例。某些有害菌如具核梭杆菌（fusobacterium nucleatum，Fn）等丰度较低。健康的肠道菌群有助于宿主肠道屏障功能维持、食物吸收代谢和免疫系统发育等，紊乱的肠道菌群可能导致疾病。

CRC病人肠道微生态组成以及其他微生物与细菌间相互作用均发生改变。研究发现，CRC病人肠道内丁酸梭菌、双歧杆菌等有益菌丰度降低。与此同时，来源于口腔的细菌增多,部分有害菌丰度增加，如Fn、厌氧消化链球菌、产肠毒素脆弱拟杆菌等。有些病人肿瘤组织内也发现Fn等细菌富集[2]。在CRC不同发展阶段，肠道菌群的构成发生不同变化。如Fn在腺瘤阶段就有富集，进展期Fn的丰度进一步增加。龋齿放线菌的丰度则是先明显增加，然后稍有降低[3]。有研究报道，CRC病人存在肠道真菌紊乱，担子菌门和子囊菌门的比例升高。健康人肠道中部分真菌与细菌间的共生关系，在CRC病人中转变成拮抗关系。有研究用宏基因组学方法比较CRC病人与健康人的肠道病毒。CRC病人肠道病毒组总体丰度和多样性均增加。且处于不同肿瘤分期的病人，其肠道病毒组改变各有特征。噬菌体组与来源于口腔的细菌也存在不同的相互作用。

目前菌群与CRC的相关性被普遍认可，但孰因孰果仍需进一步论证。微生物确实可能通过多种途径诱导癌症的发生。异常的肠道菌群结构可能引起机体免疫系统紊乱从而削弱肿瘤免疫，亦可引起慢性炎症反应或发酵食物产生毒性化合物，增加癌症风险。个别细菌也可直接促进CRC的发生。如Fn可通过细菌表面黏附素FadA与钙黏蛋白E结合，从而激活β连环蛋白和Wnt通路。Fn也通过活化TLR4和NF-κB来上调癌基因miR21的表达，直接增加癌细胞的增殖。富集在肿瘤内的Fn通过调节免疫细胞的水平和功能影响肿瘤微环境的免疫状态。有研究报道，肿瘤微环境中的Fn对免疫应答的调控受到微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）状态的影响[4-5]。 表达聚酮合成酶基因的大肠埃希菌（pks+escherichia coli，pks+E coli）可产生毒素colibactin，直接造成肠道组织DNA损伤。研究者在5%的肠癌样本中检测到colibactin[6]。肠道菌群亦有可能影响CRC的发展和预后。较高的Fn含量与较低的总体生存率有关（风险比1.63）[7]。有研究发现，肿瘤组织中Fn高拷贝的病人5年生存率与Fn阴性病人相比，下降大于10%[8]。还有研究发现，组织中的Fn可通过自噬途径诱导CRC对化疗产生抵抗[9]。另有研究报道，病人肠道内较低的脆弱拟杆菌丰度，较高的普拉梭菌和索氏甲基杆菌丰度与较好的预后有关[10]。目前研究初步揭示某些有害细菌如Fn在CRC细胞突变或治疗脱敏中起到重要作用。但由于临床疾病的复杂性和疾病模型的异质性，肠道菌群与CRC发生、发展的因果关系仍未得到完整的解释。细菌在多少肠癌病例的发生中起作用，在什么程度上发挥怎样的作用，还需进一步研究。

肠道菌群结构和丰度异常判断CRC生物标志物的可行性

从正常结肠黏膜发展成为腺瘤，最终成为CRC需经过若干阶段，可能至少10年。期间任何一个阶段采取措施都可能避免CRC的发生。即使已确诊为癌，在癌症早期接受治疗的病人5年生存率也可达90%。因此，对于结肠直肠腺瘤及CRC的早期筛查意义重大。现有常用的无创筛查方法有粪便免疫化学检测（faecal immunochemical test，FIT）和粪便多靶点分子检测等。其中FIT对CRC和高级别腺瘤的灵敏度分别为69%～85%和21%～31%。多靶点检测对于高级别癌前病变的灵敏度仅46%。因此，探索新的无创筛查手段很有必要[11-12]。

由于CRC以及结肠腺瘤病人肠道微生态与健康人不同，粪便微生物及代谢产物的特征性改变可能成为CRC早期筛查的生物标志物。已有多项研究利用特征性肠道微生物构建CRC诊断模型，粗略可分为以下4种：以Fn为主的个别菌种作为生物标志[13-14]；以3个以上的细菌组合为生物标志[15]；包含病毒、真菌或代谢产物等为生物标志[16-17]；以及上述微生态标志结合FIT等化学检测联合构建的预测模型[1，18]。以受试者工作特征曲线下面积（area under curve，AUC）评价模型准确性。上述模型的AUC大多在0.80～0.98。有研究针对粪便Fn单个指标的预测准确度进行荟萃分析。该指标对CRC和腺瘤的预测灵敏度分别为71%和36%，与FIT检测相似[13]。Fn与共生梭菌联合预测早期CRC灵敏度高于FIT和癌胚抗原检测[1]。Fn与双歧杆菌、普拉梭菌丰度的比值也可成为CRC的生物标志（AUC=0.943），对Ⅰ期CRC预测灵敏度达 90%（AUC=0.804）[14]。中国香港的团队用qPCR技术检测Fn和微小小单胞菌的特征基因丰度，可预测早期 CRC（AUC=0.84）[19]。Coker等[16]利用 16 种真菌为生物标志，CRC与对照区分的AUC为0.74～0.93。Nakatsu等[17]以22种病毒作为生物标志，可一定程度上预测CRC。以上不同研究构建的预测模型不完全相同，但所报道的CRC生物标志菌株多来自于梭杆菌科、韦荣球菌科、梭菌科、普雷沃菌科、瘤胃球菌科和紫单胞菌科等，且与较高的次级胆汁酸合成基因丰度有关。多项荟萃分析报道粪便微生物作为CRC诊断模型的准确性和稳定性。其中Thomas等[20]分析不同来源的7个队列数据。经交叉队列验证，以粪便菌群组合为生物标志的CRC诊断模型平均AUC为0.84，而健康人腺瘤预测模型的平均AUC为0.79。这意味着肠道菌群结构和丰度异常有可能成为CRC筛查的指标之一。

CRC的预后也与肠道菌群密切相关。对特异性微生物的鉴定与检测有助于预测CRC的疗效与预后。肿瘤组织Fn丰度较高的CRC病人预后可能较差。Yamaoka等[8]根据Fn拷贝数构建Ⅳ期CRC总体生存期预测模型，AUC达0.83。将每纳克DNA含4.9拷贝Fn作为临界值，灵敏度和特异度分别达90.9%和88.9%。有研究发现，Fn可通过调节自噬诱导肿瘤对化疗产生耐受性。以Fn为生物标志物预测CRC化疗后复发AUC为0.776，预测效果优于美国癌症联合委员会的癌症分期[9]。基于现有的研究，不同报道的特异性菌群以及预测模型的准确性有差异。这可能因病人特征和研究方法存在异质性。尽管如此，肠道菌群作为判断CRC诊断和预后的生物标志物仍有一定可行性。需开展更多的临床研究，以达到模型的优化和标准的统一。

微生物干预助力CRC的防治

基于肠道微生态对CRC发生、发展的影响，肠道菌群干预可能起到预防CRC的作用。具体方式包括合理应用抗生素、饮食调节、补充益生菌和益生元等。有研究报道，口服青霉素类抗生素增加结肠癌患病风险，而口服四环素类则降低直肠癌风险。这可能与不同类型抗生素对肠道菌群造成不同影响有关[21]。尽管抗生素使用对CRC患病风险的影响仍待更多研究证实，但避免某些抗生素的过度使用可能有助于预防CRC。饮食结构也与CRC的发生有关。“节俭饮食”（摄入较多全谷物与膳食纤维）结构与“西方饮食”结构（摄入较多红肉及饱和脂肪）相比，前者CRC发病率较低。研究报道，饮食模式对结肠细菌总量、产丁酸菌以及作用于胆汁酸代谢的细菌丰度有明显影响[22]。“节俭饮食”可降低Fn阳性CRC的发生率，对Fn阴性肿瘤的发生率无明显影响。这也说明饮食、肠道菌群与CRC发生甚至预后之间的联系[23]。部分动物研究发现，补充益生元或益生菌可一定程度预防CRC或癌前病变。较常用的益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌和酵母菌等。其机制可能与肠道微生物参与调控宿主肠道屏障、代谢、炎症、氧化应激、基因修饰和细胞自噬通路有关[24]。但对于益生元或益生菌是否可降低人群CRC患病风险，结论尚不一致，需更多大样本临床研究。

现有的肿瘤治疗手段有手术、化疗、放疗以及免疫治疗。多项研究揭示，肿瘤治疗有效率以及不良反应均与肠道菌群有关，甚至某些细菌本身就具有抗癌性。因此，针对病人肠道菌群制定个性化治疗方案、微生态干预以及合成微生物的应用，可能在提高肿瘤疗效和减少不良反应中起到重要作用。在CRC动物模型中，干酪乳杆菌可预防氟尿嘧啶/奥沙利铂化疗引起的肠损伤[25]。有研究将载有氟尿嘧啶的纳米材料包被在罗伊乳杆菌中，使口服药物在结肠直肠缓慢释放[26]。还有将改造后的噬菌体与包裹伊立替康的纳米材料结合，靶向抑制Fn生长，提高CRC化疗效果且不增加肝、肾毒性[27]。临床研究显示，补充益生菌可能减少手术或化疗并发症发生，如严重腹泻和围术期感染等[28]。免疫疗法是肿瘤治疗方法上的一大突破。肠道微生态被视为预测免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）疗效的生物标志[29]。已有关于粪菌移植成功治疗免疫相关性肠炎，以及提高PD-1/PD-L1抑制剂治疗恶性黑素瘤效果的案例报道[30]。也有学者提出，粪菌移植用于CRC辅助治疗的设想。目前ICI在CRC中的应用仅限于治疗高度MSI的癌灶，而其他类型CRC对ICI治疗一般不敏感。有研究发现，组织Fn丰度与MSI水平相关。因此，以Fn为靶标的干预措施可能会提高CRC对免疫治疗的灵敏度[31]。

小 结

近年来，对肠道微生态与CRC的关系已初步形成较全面的认识。较多研究阐述菌群参与CRC发生的机制、微生态特征用于CRC临床预测以及肠道菌群与肿瘤治疗的关系，为肠道菌群的临床应用提供一定基础。但在不同类型的CRC病例中,肠道菌群究竟起多少作用，菌群生物标志物的研究真正能给临床带来多大的应用价值，至今尚无定论。需要开展更多的机制探索和临床研究。随着科技不断进步，很多独具特色的体外模型正用于CRC微生物组研究中，如肠道芯片和3D肠道类器官等。人工智能、纳米材料和基因编辑等技术也日渐成熟。相信肠道菌群研究能为CRC的临床诊治带来新的突破。