质谱成像技术与肝癌标志物的研究进展

李彦飞 刘敏

厦门大学附属翔安医院感染科，福建 厦门 361102

质谱技术的发展源于化学领域，最早用来测量离子的质荷比。在医学领域的应用过程中，质谱成像技术(mass spectrometry imaging，MSI)与传统检测方法相比发挥出更为独特的优势，即不用向样本中人为添加各类标记物就可以同时检测出多种分子，并获取空间分布信息，这对于小分子化合物的检测尤为精准，克服了免疫方法中抗体特异性不强的瓶颈，为许多疾病的诊断及病理生理学机制的探究提供可靠的手段。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是很多慢性肝脏疾病终末期最常见的并发症[1]。在我国，乙型和丙型病毒性肝炎是肝硬化进展为肝细胞癌最重要的危险因素。此外，酗酒和各种代谢疾病，比如糖尿病，也是相关的危险因素[2]。肝癌由于其发病过程隐匿而大都不能早期发现和诊断，大部分患者确诊时已进入晚期，失去手术机会。目前，临床实践中，活检联合影像学检查被推荐为诊断肝脏疾病的金标准[3]。但由于肝组织活检是创伤检查，可能导致肿瘤细胞转移，另外由于超声等影像学检查精度低，不能对早期原发灶进行精准的检测并定位，因此，尽快找出一种作为诊断依据的可应用于临床的肝癌标志物是亟待解决的问题。

1 质谱成像技术简介

1.1 质谱成像技术基本原理与分类

质谱成像技术原理大体包括4步：①低温条件制备组织切片并转移到电导靶上,喷涂基质并干燥(制备样本)；②用激光或离子束照射使组织和细胞表面的目标分子离子化(离子化)；③通过质谱测定这些离子化分子的质荷比(分子质量分析)；④由专门的软件重新构建目标分子在组织中的分布图(构建图像)。质谱成像技术按离子化方式不同分为3类，基质辅助激光解吸电离(matrix- assisted laser desorption ionization, MALDI)，解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization,DESI)，二次离子质谱(secondary ion mass spectrometry，SIMS)。

在MALDI MSI中，基质拥有吸收荧光的能力，并可经由某种方式与组织样品表面的被测分子结合。当激光束照射基质时，基质吸收激光能量，同时使得被测分子发生解吸，解吸后的被测分子与基质都已气相化，二者之间发生质子转移反应，再形成离子，其中大部分以准分子离子的形式存在；最后通过质谱检测，利用专业重构程序构建分子在样本中的分布图谱。有多种质量分析器可以与MALDI联合使用，常见的有飞行时间质量分析器、四极杆- 飞行时间串联质量分析器、离子阱质量分析器和傅立叶变换离子回旋共振质量分析器。此外，MALDI还拥有较大的盐容忍度和质量检测范围。

在DESI MSI技术中，首先由电喷雾制造带电液滴，进而使样本表面产生次级带电液滴，这些液滴具有溶解多种分子的能力。与电喷雾离子化(electrospray ionization，ESI)产生气相离子的方式类似，离子化分子在常压、空气的条件下直接进入质谱仪，完成质荷比的测量[4- 5]。DESI常与线性离子阱和飞行时间等质量分析器联用[6- 7]，它的空间分辨率和灵敏度比MALDI MSI低，但可以在正常气压下使用，能够维持被测物质原有的性质。

与上述两种技术不同，SIMS的作用方式是让高能初级离子撞击样品表面，并且进入样本，之后将动能传递给被分析的原子和分子。当原子或分子得到的动能大于样品表面的互相作用能时，次级离子就从样品表面释放出来。SIMS技术的优点是样本的处理过程比较简单，组织切片不经洗涤便可直接转移至质谱靶板，大大降低了分子流失和移位的可能性。另外，SIMS MSI还有高空间分辨率的优势，但其质量检测范围不如MALDI MSI和DESI MSI大,灵敏度随质荷比增加而下降，当质荷比大于1 000时下降尤为明显。

1.2 质谱成像技术数据采集和处理

质谱成像技术的两种数据采集模式是imaging(高分辨率)和profiling(低分辨率)[8]。Imaging模式以50～200 μm大小的分辨率扫描整片组织，之后上万个像素点按照被测物质信号强度组成图像，表征分析物在组织表面的分布。Profiling模式通常在组织表面取5～20个直径约1 mm的点进行检测，其结果可以用于后续统计分析。以上两种模式在实际检测中常常结合使用。

实验目的不同，样品预处理的方式也不同，加之质谱仪的性能各有差别，因此适当的数据预处理对于质谱数据分析十分必要，这样不仅除去了数据噪声，也减小了系统误差。目前应用较广的质谱数据预处理方法包括数据约简、谱线平滑、基线校正、标准化感兴趣区分析等[9]。

2 质谱成像技术在肝癌研究中的应用

2.1 肝癌的常用诊断手段

目前对于肝癌的早期诊断主要根据血清甲胎蛋白(alpha- fetoprotein，AFP)含量高低及影像学发现的联合检查，确诊往往需要有创的组织学活检，比如手术活检、CT或超声引导下穿刺活检等，这些手段有时会给病患带来身体和心理上的负担。血清肝癌标志物的检测是常用无创性诊断之一，可以为医生提供有利的诊断依据，但兼备高特异性及高敏感性的肝癌标志物尚不存在。临床常用的肝癌标志物有：甲胎蛋白、扁豆凝集素结合型甲胎蛋白、谷氨酰转肽酶(GGT)、γ- 羧基凝血酶原(DCP)，新型肝癌标志物有：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、骨桥蛋白(OPN)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素生长因子1(IFG- 1)，这些标志物在一定程度上可以满足大多数临床病例的诊断，但有证据表明，近年来一些AFP阴性或低浓度肝癌的比例不断增多，从而降低了诊断早期肝癌的效果[10]。

2.2 质谱成像技术在肝癌诊断中的探索

2.2.1蛋白质和多肽

目前质谱成像技术在肿瘤领域的应用主要围绕蛋白质和多肽领域，包括肿瘤标志物发现及肿瘤诊断，生存期较长及生存期较短患者的预后对照及患者对治疗药物反应的研究[11]。有学者用MALDI MSI对食管癌、结肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及甲状腺癌样本进行检测，以期发现鉴别各类肿瘤明确的蛋白标志物[12]。虽然检测到了某些蛋白可以作为肿瘤疾病的潜在标志物，但尚需大样本检验和反复筛选，以及建立可靠的肿瘤疾病数据库。

在肝脏肿瘤方面，有研究对肝癌患者、肝炎患者和健康对照各20例血清样本进行双向电泳- 质谱分析[13]，结果显示肝炎组和肝癌组都低表达的有转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白，而在两组均高表达的有α- 1抗胰蛋白酶、凝集素、铜蓝蛋白、触珠蛋白。此外，α- 1抗胰蛋白酶的表达在肝癌组最高，而热休克蛋白27只在肝癌组表达。另有学者联用同位素标记相对和绝对定量((isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ))标记技术和MALDI- TOF- MS串联质谱技术，对20例肝癌患者和20例健康对照的血清进行差异蛋白组学分析[14]，并将文献报道的肝癌相关标志物数据与肝癌血清差异蛋白组学数据进行对比，结果显示与文献报道表达水平一致的差异蛋白为6个，分别为α- 1- 抗胰蛋白酶、载脂蛋白E 、蛋白血浆铜蓝蛋白、甲胎蛋白、补体C3和血清淀粉状蛋白P片段。以尿液作为标本,有文献报道DJ- 1蛋白、染色质组装因子和热休克蛋白60在肝癌细胞中均过表达[15]。在探索新型检测技术方面，有研究者尝试在优化免疫质谱检测法的基础上，用多肽抗体免疫富集- 质谱法发现了浓度为35.2 nmol/L的肝癌血清多肽标志物，初步建立了完整的血清多肽标志物的免疫质谱方法[16]，对血清中低浓度标志物的检测有很好的启发。

肝脏作为血清蛋白的主要合成器官，其合成的蛋白质和多肽承载着各种生命活动，病变的肝细胞和正常的肝细胞相比，有多少种差异蛋白表达目前还不清楚。一种或几种差异蛋白的表达可能意味着疾病不同的临床表现和病情进展。因此，通过归纳不同的肝癌临床特点来发现新的肝癌蛋白标志物是一种可行的尝试。

2.2.2蛋白质和多肽区分良恶性和识别转移病灶

当在临床上发现就诊者存在肝占位或可疑肝癌的表现时，最迫切的是诊断出疾病的良恶性，其次是有没有转移。目前区分良恶性的手段仍是活检。少数病例可以通过明显的临床症状和体征以及既往病史做出诊断，但仍然不能作为可靠的诊断手段。有学者尝试用质谱分析识别肝癌特异性多肽，期望建立区分良恶性肝肿瘤的分类模型[17]。该研究用弱阳离子交换色谱磁珠分别逐一处理肝良、恶性肿瘤患者的血清样本，并用基质辅助激光解离飞行时间质谱成像分析，结果显示质谱成像技术有助于区分肝的良恶性肿瘤，纤维蛋白原和间- α- 胰蛋白酶抑制剂重链H4(inter- alpha- trypsin inhibitor heavy chain H4,ITIH4)的2型同工体可能用于诊断恶性肝肿瘤的血清标志物。

在识别有无转移方面，PET- CT是可靠方法，但其仪器专业性强，花费高昂，暂时难以普及。有学者用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix- assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI- TOF- MS)分析肝细胞癌骨转移患者的血清样本66例，没有骨转移患者的血清72例[18]。结果有7个多肽的序列被识别，它们分别来自甲胎蛋白、凝血酶原、丝甘蛋白聚糖、 ITIH4、自噬体相关蛋白16- 2的1型同工体,以及转甲状腺素蛋白和纤维蛋白原β链，敏感性和特异度达80%以上。

相比鉴别是否发生肝癌，良恶性和转移灶的判断似乎难度更大，良恶性的问题还应包括判断病理类型，转移灶的问题则还应包括判断是否是肝源性。肝癌细胞作为非正常细胞，其中哪些蛋白发生了变化，到底发生了哪些变化，仍然需要大量基础和临床的探究。

2.2.3DNA和RNA

如果蛋白质的功能受损或改变，人们自然会想到是否有核酸分子结构顺序发生改变。复制、翻译和转录任何环节出现不可逆差错，都会使蛋白质表达出现异常，进而使细胞正常功能受损，甚至癌变。国外研究人员使用MALDI质谱成像对30例肝癌组织和癌旁肝硬化组织蛋白质组进行比对，结果显示有13种蛋白质/肽类可以有效区分肝癌组织和肝硬化组织[19]，其中表达最强的是单体泛素(质荷比8565)，同时该研究还论证了泛素的增加并不是肝癌细胞内泛素基因表达上调的结果，而是通过转录后调控完成的，这就使蛋白质表达更加复杂。RNA修饰在肝癌发病原因中的研究尚处于初期，但以质谱成像技术为基础所建立的RNA修饰分子谱无不显示出其巨大潜能和敏感性，包括大家比较熟悉的5’帽子和3’多聚A结构，以及RNA剪接和编辑。除了mRNA,还有种类繁多的非编码RNA的功能成为当下分子生物领域的热点，其中tRNAs和rRNAs的修饰要比mRNAs的修饰更为复杂[20]，许多奥秘值得探讨。

近来，DNA的损伤也成为肝癌发生的研究热点，包括点突变、缺失、插入、倒位或转位等。其中质谱成像联合色谱技术正在成为研究DNA加合物谱系的重要工具，可以发现许多与生命过程相关的表型。DNA加合物是经代谢活化后的亲电性物质与DNA碱基上亲核位点共价结合形成的化合物，这些亲电物质可由环境暴露产生，或因体内应力产生，且具有反应活性[21]。正常情况下，这种结合可以启动DNA的修复过程，假如这类修复没有在DNA复制前启动,则会导致染色体重排和(或)核苷酸的替代与缺失。既往常用32P- 后标法检测DNA加合物，质谱技术发展后，出现了靶向分析和非靶向分析两种方法，前者首先运用质谱扫描依次检出期望加合物，然后尝试构建肝癌样品的DNA加合物谱系；后者先根据DNA加合物结构的共同特征，筛选出具有判断身份特征的化合物，再依次鉴定，最终得到样品的DNA加合物谱系。很多经典肝癌致癌物与此有关，例如，黄曲霉毒素B1就和TP53基因的第249密码子(249Ser)突变有关，后者易导致肝癌发生。另外，还有烷化剂、多环芳烃、杂环芳香胺等，它们通过促使DNA甲基化和氧化，使8- 羟基- 2’- 脱氧鸟苷升高，对生物体产生损伤。慢性乙型、丙型病毒性肝炎等也可通过损伤DNA诱发肝癌发生[22]。

2.2.4代谢产物

除了蛋白和核酸的检测，多种小分子代谢物(脂质、氨基酸、单糖类、核苷酸等)在细胞的能量转化、催化反应、信号转导、免疫防御等生命活动中扮演重要角色，也可以用来检测肿瘤疾病的发生发展。

有学者得出某些脂类代谢物升高与肿瘤疾病正相关的结论[23]，同时还发现高强度电场下喷涂基质有助于提高基质均匀度和质谱检测低分子量代谢的灵敏度和检出率。又有研究人员用超高效液相色谱串联质谱检测了32例肝细胞癌、30例肝硬化和25例慢性乙型肝炎的血清样本[24]，发现比起AFP,血清脂质组学可以更好的诊断肝硬化。该方法区分肝硬化和肝细胞癌的灵敏度是78%，特异度是64%(AFP分别是38%和93%)，区分肝癌和慢性乙型肝炎的灵敏度和特异度都是100%，这些脂类包括甘油磷脂、甘油磷酸丝氨酸和甘油磷酸肌醇。脂类作为三大营养物质，在人体的多种生理生化过程中起到不可替代的作用，肝脏作为合成脂类物质的重要器官，其不同病变必然导致某些脂质的数量和功能发生不同程度的改变。某些以质谱技术为导向的代谢组学课题显示，人血清中的胆汁酸、长链肉碱和小肽段都有可能将早期肝癌患者从肝硬化病例中鉴别出来[25]。此外，可以用GS/MS检测尿液样本中的代谢物，其中乙醇胺、乳酸、乌头酸、苯丙氨酸和核糖的含量可以预测肝癌的复发情况[26]。

2.2.5多糖

由于很多血清糖蛋白是肝源性的，可以推断与异常糖基化有关的肝脏疾病可以揭示糖蛋白的重要改变[27]。蛋白的糖基化主要由糖基转移酶催化完成，使糖类化合物和蛋白质的某些氨基酸残基之间形成糖苷键，主要有N- 糖基化(天冬酰胺为受体)、O- 糖基化(丝氨酸或苏氨酸为受体)和糖氨聚糖(糖基磷脂酰肌醇锚)，其中N- 糖基化是血浆等体液中蛋白糖基化的主要方式，与肝脏肿瘤发生最为密切。有学者发明了用质谱成像绘制冰冻肝细胞癌组织和福尔马林固定肝细胞癌的组织中N- 聚糖的二维分布的方法[28]，并用该方法评估了30多种N- 聚糖。

MALDI- MS是分析临床样本N- 糖组学的有效手段，并已经广泛用于识别肝细胞癌的N- 聚糖[29]。另一研究体液多糖和糖蛋白的较为实用的技术是ESI- MS，可以用来发现某些潜在的肿瘤标志物[30]。由于几乎所有的肿瘤标志物都是糖蛋白或糖抗原，用质谱成像分析肝癌组织切片的N- 多糖标志物将继续进行和发展。有研究用多植物凝集素亲和层析技术分别从20例肝癌和20例非癌慢性肝病患者的血清中纯化N- 连接糖蛋白，并用IgY12去除血清高丰度蛋白，再进行二维电泳分析差异蛋白，最后鉴定了18个差异表达的糖蛋白和/或其异质体[31]。就性质和功能来说，这些差异性糖蛋白是急性期反应蛋白，有着蛋白酶抑制、生物转运、凝血和纤溶等功能，从而间接说明肝癌的发生进展过程中机体产生的某些急性期反应物可能是潜在的肝癌血清标志物。

3 总结与展望

质谱成像技术利用离子质荷比对样本直接进行分析和鉴定，使得分子检测更加精准可靠，该技术在疾病诊断过程中的应用展现出新的活力。肝细胞癌的发生发展还有许多问题需要解答，从 DNA转录出mRNA，经过RNA的修饰，到之后翻译出不同功能的蛋白质，再到蛋白质通过糖基化等修饰改变自己的活性和特点，最后代谢产生小分子化合物，以上各个生命过程中都可能发现诊断肝癌的有效标志物。质谱成像技术在理论上可以检测以上所有生命过程中出现的物质，但尚需更多的时间和研究来建立疾病数据库。有学者研究人中性粒细胞肽((human neutrophil peptide,HNP)在胃癌中的上调给出了一些启发[32]，该研究基于HNPs含量在胃癌患者中升高这一事实，对其在胃癌组织中的定位和分布进行研究，最终发现MALDI- TOF- MS可以检测HNPs的含量，并且可以作为胃癌的治疗效果评估的标志物。类似的，在已发现的或未发现的多肽、脂类或多糖中，推测在肝癌组织中存在上调或下调的能用来作为评价肝癌病情状态的指标。有学者联合荧光差异双向电泳和纳米流动液相色谱串联质谱发现特异蛋白14- 3- 3γ的表达与肝癌的发生相关，参与各种细胞过程和分化。此外，还发现有16种蛋白上调，14种蛋白下调，涉及包括糖酵解、脂肪酸转运等多种代谢途径[33]。

另外一个重要障碍是在肝癌进展期的诊断中，患者往往有多重肝功能不全，缩短了生存期，限制了治疗手段的选择。用质谱法寻找多糖谱的特点可能会使我们发现用于肝癌早期诊断的无创性诊断标志物[34]。质谱成像技术在包括肝细胞癌在内的肿瘤组织识别、亚型区分、良恶性及恶性程度区分等研究方向有广泛而深刻的应用价值。除多肽外，脂类、多糖及其他代谢物都可用于研究肿瘤的特点，对多种分子的空间分布特征的揭示使质谱成像技术有巨大的基础和临床应用潜力。