桥接蛋白PALB2在乳腺癌发生机制中的研究现状

孙沙沙, 马金柱, 布日古德

0 引言

乳腺癌是全世界女性发病率最高的恶性肿瘤。2017年我国乳腺癌发病占女性恶性肿瘤的17.07%，居第一位[1-3]。现有研究提示，绝大部分肿瘤在分子水平上都会有基因异常变化,包括某些癌基因的激活、抑癌基因的失活及相关凋亡蛋白的异常,导致细胞的增殖分化异常,最终累积而导致肿瘤的发生。PALB2被鉴定为一种BRCA2相互作用蛋白，被认为是通过同源重组进行DNA修复的细胞机制中的一个齿轮。PALB2与BRCA1相互作用，被BRCA1定位，并在BRCA1下游发挥作用，且从机制上来说，PALB2通过介导BRCA2和RAD51重组酶向DNA损伤位点的募集而为HR所必需。现对PALB2结构、生物学功能及其与乳腺癌的相关性作一综述,以期对乳腺癌的基因研究提供一定帮助。

1 PALB2的结构及其在HR中的生物学功能

PALB2基因位于16号染色体短臂(16p12.2)，包含13个外显子，编码的PALB2蛋白包含1 186个氨基酸残基，分子量为131 kDa[4]，主要作为连接BRCA复合体(BRCA1-PALB2-BRCA2-RAD51)的桥接分子，并促进RAD51的功能，同时可与多个同源重组相关蛋白结合(BRCA1、BRCA2、RAD51、RAD51C、MRG15 等)，在DNA损伤修复过程中发挥着重要作用。PALB2在HR中的作用已经被证明涉及到几个蛋白质结构域，包括卷曲的螺旋结构域、WD40结构域和染色质结合基序(ChAM)。

卷曲螺旋结构域位于PALB2(残基9-42)的N末端，负责其与BRCA1的相互作用。除了积极调节HR外，BRCA1-PALB2相互作用还需要防止单链退火(Single strand annealing,SSA)，这是一种导致DSB修复的缺失途径。Anantha等[5]使用U2OS/DR-GFP和U2OS/SA-GFP报告细胞，证明PALB2或BRCA2的耗竭导致HR活性受损，SSA显著增加，而BRCA1的耗竭则导致HR和SSA活性的降低。这些结果证实BRCA1是DSB修复的关键，而PALB2则是引导DSB修复走向切除后的HR通路。在电离辐射后发现PALB2(S59、S157和S376)的三个N端S/Q位点发生磷酸化，磷酸化事件由共济失调毛细血管扩张突变蛋白和Rad3相关激酶介导[6]。磷酸化缺陷的PALB2未能促进RAD51病灶的形成，导致HR受损和基因组不稳定。

WD40域位于PALB2 C端，形状为WD40型β-螺旋桨，有7个叶片[7]。该结构域与BRCA2、DNA聚合酶η、RAD51、RAD51C和泛素连接酶RNF168相互作用[8]。即使WD40区域内的单核苷酸变化也会干扰PALB2-BRCA2相互作用并导致HR缺乏[9]。PALB2的WD40结构域对于与DNA聚合酶η的相互作用也很重要。最近，在PALB2的WD40结构域中发现了一个隐藏的核输出序列，乳腺癌相关的PALB2截短突变W1038X暴露于此，导致PALB2易位到细胞质并导致HR[10]缺陷。

ChAM是一个位于PALB2中部的进化保守的结构域。ChAM缺失的PALB2在支持MMC诱导的RAD51病灶形成中起着折衷的作用，提示ChAM通过染色质联合促进PALB2的功能。染色质结合被认为是PALB2生物学功能不可或缺的组成部分，除了ChAM，MRG15是参与PALB2染色质结合的另一个PALB2相互作用，MRG15属于高度保守的MRG蛋白家族[11]，具有两个功能域：一个是与PALB2和多个转录调节因子结合的MRG域；另一个是与赖氨酸36-三甲基化组蛋白H3结合的N-末端色域，由赖氨酸甲基转移酶集域介导。MRG15结合区大致定位于PALB2的中间区域(残基611-764)，与两个高度保守的区域(残基611-629)和MBD-II(残基724-737)完全匹配[12]。Bleuyard等[11]提出MRG15-PALB2复合物可能是活性基因中的一种基因组稳定剂，使PALB2在DNA损伤后立即可用，并保证对复制胁迫的快速反应，从而维持基因组的稳定性。除了MRG15-PALB2相互作用外，PALB2在复制应激期间也被磷酸化复制蛋白A募集。Murphy等[13]揭示了在复制应激期间RPA的磷酸化刺激PALB2的募集并增加PALB2染色质结合的稳定性，使PALB2可用于缓解复制应激并促进停滞的复制分叉的恢复。ChAM与核小体结合并参与染色质上PALB2-BRCA2-RAD51复合物的形成，在DSBs后迅速转化为活性BRCA复合物。

除了BRCA复合物的形成，PALB2还直接与RAD51相互作用，增强其侵入链活性[14]。最近，Deveryshetty等[14]表明，PALB2的主要DNA结合域(DBD)位于其N-末端(N-DBD，残基1-200)。N-DBD中只有4种氨基酸突变显著干扰PALB2的HR活性。令人惊讶的是，作者发现PALB2的N-DBD增强了RAD51介导的链交换，并且在没有RAD51的情况下也促进了类似的反应。利用链交换荧光分析，他们进一步证明PALB2 N-DBD促进了以DNA或RNA为底物的正向和反向链交换。

2 PALB2与BRCA1、BRCA2的相互关系

PALB2作为BRCA2细胞核内定位、转移和稳定的协同因子，PALB2末端的WD40重复序列介导其与BRCA2相结合，再通过卷曲螺旋结构域直接与BRCA1相互作用，来修复DNA损伤。在DNA损伤修复过程中，PALB2绑定BRCA1和BRCA2，形成BRCA1-PALB2-BRCA2分子支架，促进intraS端DNA损伤检测点和同源重组功能的发挥[15]。

许多研究证明了BRCA1在HR途径中的直接作用，因为BRCA1缺陷细胞显示出严重受损的HR介导的DSB修复[16]。继DSB之后，BRCA1通过abraxas-RAP 80大复合体与DSB结合，从而诱导组蛋白在脱氧核糖核酸双链体上的泛素化[16]。BRCA1-abraxas-RAP 80复合物的形成依赖于组蛋白H2AX的磷酸化，组蛋白H2AX是DNA损伤检查点蛋白1和环指蛋白8的介体[17]。随后，BRCA1通过与Mre11、Rad50、Nbs1的协同作用与CtIP形成复合物，以在HR的合成依赖性链退火途径的早期步骤中促进5’末端切除[18-19]。虽然BRCA1-CTIp复合物已被证明对鸡DT40细胞中的HR途径至关重要，但另一项研究报告称，这种相互作用对于切除介导的哺乳动物细胞中的DNA修复或肿瘤抑制不是必需的[20]。接下来，BRCA1与PALB2和BRCA2相互作用，招募RAD51，RAD 51是HR修复途径中的一种重要介质。BRCA1-PALB2- BRCA2复合物的形成依赖于CHK2介导的BRCA1上S988的磷酸化作用[21]。BRCA1在HR中的功能不同于其在DNA损伤修复应答(DNA damage response,DDR)中的其他功能。表达BRCA1突变体S988A的细胞具有缺陷的HR修复途径，尽管检查点调节或对电离辐射的抗性保持完整[22]。此外，研究发现，T1394磷酸化残基对BRCA1-PALB2的相互作用有影响，该位点的任何突变都会部分损害HR途径的活性。

BRCA1-BACH1复合物也有助于HR途径。该复合物不受心率限制，涉及许多DNA修复途径，如细胞周期检查点和DNA链间交联修复[23]。BACH1是一种范可尼贫血(Fanconi贫血，FA-N)蛋白，通过磷酸丝氨酸与BRCA1的BRCT结构域相互作用[24]。BACH1或BRCT结构域中的突变可能破坏BRCA1和BACH1之间的相互作用，影响HR途径，延迟DNA修复，并最终增加乳腺癌的风险[25]。

BRCA2通过实现基于同源重组的无错误DNA双链断裂修复和S期DNA损伤检查点控制，充当基因组完整性的“看护者”。而PALB2，一种BRCA2结合蛋白，与核病灶中的BRCA2共聚焦，促进其在关键核结构中的定位和稳定性(例如染色质和核基质)，并使其发挥重组修复和检查点功能。此外，在乳腺癌患者中发现的多个种系BRCA2错义突变，似乎破坏了PALB2与BRCA2的结合并使BRCA2-HR/DSBR功能失效。因此，PALB2维持BRCA2关键细胞的生化特性，并确保其肿瘤抑制功能。

3 PALB2与乳腺癌

大量研究表明，PALB2的双等位基因突变导致范可尼贫血，而PALB2的单等位基因突变使携带者易患多种癌症，如乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌[26]。

乳腺癌是最常见的癌症，也是全世界女性癌症死亡的主要原因[27]。大约10%～15%的乳腺癌病例是由家族和遗传因素引起的，这突出了遗传易感性在乳腺癌发展中的重要意义。以前的研究已经确定了广泛的乳腺癌易感基因，包括BRCA1、BRCA2和TP53[28]。然而，家族性乳腺癌的易感基因(如乳腺癌的家族性外显率为13%，仅占乳腺癌总患病率的13%)。最近对多基因面板测试的大规模分析证实了PALB2是一个高危的乳腺癌易感基因[29]，并且PALB2突变对乳腺癌的优势比(OR)与BRCA2突变的比值比相当[30]。因此，全面了解PALB2的生物学功能对于乳腺癌的治疗和精确的医学治疗至关重要。

PALB2与乳腺癌密切相关，并与乳腺癌的易患性、临床病理特征和预后有关。研究测定了家族性乳腺癌队列中BRCA突变阴性的PALB2单等位基因截断变异的频率(10/923，1.1%)，对照组(0/1 084，0%；P=0.000 4)。同时，具有单等位基因PALB2突变的个体患乳腺癌的风险增加了2.3倍(95%CI:1.4～3.9；P=0.002 5)。随后，多个基于人群的PALB2截断突变筛查报告显示，PALB2截断突变携带者患乳腺癌的风险增加了2～30倍[31-33]。

男性乳腺癌是一种罕见的疾病，占所有乳腺癌病例的1%以下。然而，20%的男性乳腺癌患者有乳腺癌家族史，突出了遗传易感基因与男性乳腺癌之间的强相关性。迄今为止，在男性乳腺癌患者中已报道了许多PALB2的致病变异体[34-36]。2017年，Pritzlaff等[35]发现PALB2变异显著增加了男性乳腺癌的风险(OR=6.6；P=0.01)。Rizzolo等[36]发现,在非BRCA1/2改变的男性乳腺癌患者中，PALB2是最常见的突变基因(1.2%)，而有害的PALB2变异使男性乳腺癌的风险增加了9.63～17.30倍。最近，Yang等[33]通过分析来自21个国家的524个PALB2的致病变异体家族的数据，进一步显示PALB2的致病变异体携带者的男性乳腺癌相对风险估计为7.34(95%CI:1.28～42.18；P=0.026)。

一些研究还发现，PALB2突变乳腺癌与侵袭性临床病理特征有关。Heikkinen等[37]报道乳腺癌患者PALB2 c.1592delT突变更易出现三重阴性表型(54.5%，P<0.000 1)。此外，与其他家族性或散发性乳腺癌患者相比，PALB2突变的乳腺癌患者更易出现在晚期疾病阶段(分别为P=0.002 7和P=0.001 7)，Ki67水平更高(分别为P=0.000 4和P=0.049 0)。

在研究中，PALB2突变的女性乳腺癌患者10年生存率为48.0%(95%CI：36.5～63.2)，显著低于PALB2突变阴性的女性乳腺癌患者(74.7%；95%CI：73.5～75.8)。最近，中国一项基于人群的乳腺癌易感基因筛查进一步证实了PALB2在乳腺癌中的预后价值，PALB2突变的患者与非携带者相比，总体生存期更短(校正危险比：8.38；95%CI：2.19～32.11；P=0.002)[38]。

4 PALB2缺陷的治疗

PALB2是与遗传性乳腺癌相关的基因突变。与普通人群相比，PALB2突变的女性患乳腺癌的风险增加了5倍。目前，对此突变的妇女的外科治疗缺乏研究。目前还没有专门针对PALB2突变携带者手术的研究。乳腺癌的高风险使得双侧预防性乳房切除术成为PALB2突变妇女的潜在选择。在推荐预防性乳房切除术之前，根据家族史采取逐案调查的方法，在这组患者中是合理的[39]。

聚ADP核糖聚合酶[poly(AD-P-ribose)polymerase,PARP]作为DNA损伤的传感器和调节器，在单链DNA的修复中起着重要作用，突破了碱基切除修复途径[40]。PARP抑制剂治疗可阻止单链DNA断裂的修复，并导致细胞内DSB的形成。BRCA1/2缺陷细胞不能通过HR途径修复DSBs，导致细胞死亡[41]。Rodrigue等[42]利用siRNA介导的RNA干扰产生PALB2缺失的HeLa细胞，并在PARPi敏感性试验前补充外源siRNA抗性的PALB2变异体。表达PALB2的细胞变异株p.T1030I或p.W1140G显示出明显高于表达野生型PALB2的olaparib敏感性。Boonen等[43]开发了一个基于cDNA的PALB2变异体功能分析系统。通过评估PALB2变异体挽救PALB2基因敲除小鼠胚胎干细胞PARPi敏感性的能力，他们鉴定出12个PALB2变异体(p.Y28C，p.L35P，p.W912G，p.G937R，p.I944N，p.L947S，p.L961P，p.L972Q，p.A1025R，p.T1030I，p.G1043D，p.L1172P)显示对PARPi过敏。

儿科进行的BMN673的临床前研究表明，PARPi对PALB2缺陷肿瘤具有综合致死作用。这些数据表明，为了获得最佳的临床结果，应该评估PALB2的状态，并将其纳入遗传咨询和患者治疗方案中。

5 结语

综上所述，在HR过程中，PALB2在BRCA1和BRCA2之间起着重要的桥梁作用，促进RAD51重组酶向DNA损伤位点的募集并将其组装成核丝以启动DSB修复。PALB2突变的患者与非携带者相比，患病率增加、三阴性乳腺癌病理几率大，预后差、总体生存期更短。虽众多研究者对PALB2的具体结构、多方面功能和复杂的调控网络已经进行了多方面的研究，但为了提供个体化的临床管理，需要进一步的长期、基于人群的PALB2突变研究和系统的功能验证，以积极应对乳腺癌治疗中所遇到的挑战。