EML4-ALK、VEGF、EphA2在非小细胞肺癌中的表达情况及其临床病理特征

罗丹，翟志恒，张洪亮*

(1.新疆维吾尔自治区中医医院，新疆 乌鲁木齐；2.山东省济宁市精神病防治院神经内科，山东 济宁)

0 引言

临床上肺癌的发病率较高，其中NSCLC(非小细胞肺癌)占85%以上，肿瘤发生、发展是多步骤、多基因、多阶段的过程[1]。75%NSCLC患者在发现病灶时就已经有局部转移或远处转移。目前，临床上对于NSCLC患者主要还是采用化疗治疗，但多期化疗又存在不良反应大的问题，且化疗疗效目前也遇到了瓶颈。所以目前分子生物学快速发展的背景下NSCLC治疗的研究方向又转向靶向治疗，这种针对靶基因突变的疗法整体疗效不错、毒性小。在EGFR(表皮生长因子受体)研究之后，EML4(棘皮动物微管相关蛋白4)-ALK(间变淋巴瘤激酶)被发现参与了NSCLC蛋白融合，EML4-ALK被证实参与肿瘤发生、发展过程[2-3]。VEGF是肿瘤血管生成的重要刺激因子，具有促进肿瘤血管生成、浸润、转移的作用，还与肿瘤生长、转移关系密切。EphA2在正常人体各种上皮细胞中表达水平较低，在信息传递介导中具有关键性作用，可调控多种细胞行为。详细报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年2月至12月期间我院收治的80例NSCLC患者为研究对象，其中男性47例，女性33例；年龄40～86岁，平均(54.8±0.2)岁；腺癌24例、鳞癌22例、肉瘤样癌18例、大细胞癌16例；肿瘤分期：I期22例、II期20例、III期18例、IV期20例。

1.2 研究方法

选择病理组织样本以IHC(免疫组织化学)法测定 EML4-ALK、VEGF、EphA2。 标 本 以 4% 中 性 甲醛液固定，脱水、石蜡包埋，4μm切片，以全自动免疫组织化学染色机染色，以Ventana ALK兔单克隆抗体、OptiView DAB IHC Detection Kit检测试剂盒及OptiView Amplification Kit增强扩增试剂盒及配套实际检测EML4-ALK，设置阴性对照、阳性对照。EphA2采用柠檬酸高温高压修复，PBS洗2次，3min/次，去除PBS液后滴加一抗(EphA2浓度1/100)，4℃冰箱过夜后测定。VEGF以EDTA高温修复。

1.3 结果判断

瘤细胞胞质内可见棕黄色颗粒则为EphA2阳性表达，VEGF以胞膜、胞浆、细胞间质染成黄色、棕黄色或黄褐色为阳性表达。肿瘤细胞质中出现棕黄色颗粒为EML4-ALK阳性表达。

2 结果

(1)肿瘤病理标本中EML4-ALK阳性表达26例(32.50%)。包括腺癌12例、鳞癌5例、肉瘤样癌4例、大细胞癌5例，III期13例、IV期7例、I期3例、II期3例。EML4-ALK阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移等情况无明显相关性。EML4-ALK阳性表达中腺癌比例达到46.15%(12/26)，明显高于鳞癌、肉瘤样癌等肿瘤类型，同时III期、IV期比例76.92%(20/26)明显高于I期与II期，差异显著，所以说EML4-ALK阳性表达与肿瘤类型、肿瘤分期密切相关。(2)肿瘤病理标本中EphA2阳性表达40例(50.00%)，包括腺癌18例、鳞癌17例、其他5例。III期14例、IV期18例、I期5例、II期3例。EphA2阳性表达中IV期、III期比例达到了80.00%(32/40)，明显高于I期、II期比例，所以说EphA2阳性表达与肿瘤临床分期呈正相关性。(3)肿瘤病理标本中VEGF阳性表达49例(61.25%)。其中阳性表达的49例患者中包括腺癌19例、鳞癌18例、其他12例。III期17例、IV期20例、I期2例、II期10例。VEGF阳性表达中III期、IV期比例达到75.51%(37/49)，明显高于I期、II期，差异明显，所以说VEGF阳性表达与临床分期呈正相关性。

3 讨论

ALK是酪氨酸激酶受体的一种，与白细胞酪氨酸激酶同源，都隶属于胰岛素受体超家族，在胚胎期神经系统结构、功能发展中具有重要作用，胎儿出生后ALK表达减少，脑部、睾丸、小肠等组织还存在特定mRNA表达，而健康的肺、肝脏、淋巴细胞中均无表达[4-7]。21世纪人们才发现肺腺癌的病灶中EML4-ALK融合所致的致瘤性基因突变，且EML4-ALK融合蛋白阳性NSCLC细胞株经siRNA基因被敲除沉默后抑制其生长，说明EML4-ALK融合蛋白存在致癌效用[8-10]。EML4与ALK融合后ALK胞内酪氨酸激酶区活化，导致细胞增殖、癌变。IHC、FISH(原位杂交)、RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)是检测EML4-ALK融合蛋白的主要方法，其中RTPCR对RNA品质要求高，其引物难以设计，所以实际开展起来很困难。FISH法是检测肺癌EML4-ALK融合蛋白的金标准，但其需要计算50个以上肿瘤细胞，这对难以获取足量的组织的晚期肺癌、穿刺困难患者来说不切实际。通过IHC法测定EML4-ALK快速、高效，是常规病理实验室的主要检测手段[11]。吸烟、遗传、环境、职业暴露等都是肺癌高危因素，其中吸烟是其最主要影响因素，但近些年的数据也表明不吸烟的肺癌患者在增多。也有研究报道NSCLC细胞核中雌激素ɑ受体表达，且与腺癌、女性等相关[12]。EML4-ALK融合蛋白还与肿瘤大小相关，其阳性表达是粘液性腺癌的高危因素。本组80例肺癌患者中EML4-ALK阳性表达率达到32.50%。

EphA2是存在酪氨酸激酶活性的一个基因，在肿瘤组织中表达而使其向恶性发展，在膀胱癌、结肠癌、乳腺癌及肺癌中均高表达，且肿瘤恶性程度越高、病理分期越高其表达水平越高[13]。本组研究结果中EphA2阳性表达率达到50.00%。VEGF是血管生成因子在NSCLC中的高表达情况早已被证实，且与肿瘤组织学类型、分化程度无明显关系，而与临床分期、淋巴结转移关系密切[14-15]。未形成相关血管供养的肿瘤细胞处于休眠状态，但是一旦肿瘤组织亚型细胞转化为促血管生成表型，肿瘤组织便开始生成血管。新生血管生长后肿瘤细胞快速增殖，且增值率远超凋亡率，肿瘤便进入快速发展阶段，并出现转移、浸润。所以说肿瘤的生长依赖于生成的血管来提供营养物质，VEGF则是调控肿瘤血管生成的重要因子，且是其正向调节因子，与肿瘤侵袭及转移都关系密切。本组中VEGF阳性表达率61.25%。

综上所述，在NSCLC中EML4-ALK、VEGF、EphA2均具有极高的阳性表达率，其异常表达与肿瘤分型、分期、淋巴结转移等关系密切，可作为NSCLC病情诊断、预后评估的参考指标，也可为靶向治疗提供一定依据。