急性脑血管病患者MTHFR基因多态性分布及血清同型半胱氨酸、脂蛋白相关磷脂酶A2水平的临床研究*

刘 畅，钱 丹，田 野，刘 飞

(陆军军医大学第二附属医院检验科，重庆 400037)

急性脑血管病患者以急性脑出血、脑血管栓塞及短暂性脑缺血发作(TIA)为主要临床表现。目前急性脑梗死发病率占急性脑血管病的70%，其病情发展快，易复发，致残率、致死率高，发病后所造成的脑细胞水肿、坏死无法逆转，严重危害人类健康[1-3]。研究表明，急性脑血管病的发病呈基因多态性，且与年龄、饮食、环境等因素相关[4]。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) 作为甲硫氨酸-叶酸代谢过程中的关键酶，维持血浆同型半胱氨酸(Hcy)的正常水平[5]。MTHFR的基因多态性包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G。其中MTHFR C677T 基因多态性使酶的活性降低，导致Hcy的代谢途径受阻，引起高同型半胱氨酸血症。研究表明，高水平Hcy是独立于高血脂、高血糖、高血压等引发急性心脑血管疾病的危险因素[6]。血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)属于磷脂酶A2超家族，是一种新的具有血管特异性的炎性标志物。Lp-PLA2可通过分解氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)产生溶血卵磷脂(Lyso-PC)和氧化型游离脂肪酸(ox-FFA)，引起单核细胞浸润和泡沫细胞沉积，促进不稳定斑块的形成，是缺血性心脑血管疾病的独立风险预测因子[7-8]。

为了进一步探讨MTHFR C677T基因多态性与Hcy、Lp-PLA2在急性脑血管病中的关系及独立危险性，本研究通过对急性脑血管病患者MTHFR C677T基因型分布、患者血清Hcy及Lp-PLA2水平的分析，明确急性脑血管患者MTHFR C677T基因多态性与血清Hcy、Lp-PLA2水平的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1-12月陆军军医大学第二附属医院神经内科以急性脑血管病收治入院的患者共328例，其中男210例，女118例；年龄23～94岁，平均(63.50±12.20)岁。根据临床诊断分为急性脑梗死组(153例)、急性脑出血组(78例)、TIA组(97例)。急性脑梗死组中男101例，女52例，平均(62.39±12.33)岁。急性脑出血组中，男55例，女23例，平均(65.65±12.38)岁。TIA组中，男56例，女41例，平均(63.44±11.79)岁。纳入标准：急性脑血管病患者均经过详细查体、病史询问及影像学检查，符合《中国脑血管病防治指南》诊断标准。排除标准：诊断不明确的脑梗死、脑出血、TIA，恶性肿瘤，血液系统疾病，严重心、肝、肾功能不全。

1.2仪器与试剂 MTHFR C677T基因检测采用杭州博日PCR扩增仪，试剂盒购于深圳泰乐德医疗有限公司。Hcy检测采用美国贝克曼全自动生化分析仪，试剂盒购于宁波瑞源生物科技有限公司。Lp-PLA2检测采用烟台艾德康全自动酶免分析仪，试剂盒购于天津康尔克生物科技公司。

1.3方法

1.3.1MTHFR C677T基因多态性检测 患者空腹采集静脉血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝。标本前处理及PCR扩增的具体操作步骤按照试剂盒使用说明书进行。PCR反应条件为50 ℃ 2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环；72 ℃延伸2 min。

1.3.2血清Hcy、Lp-PLA2检测 患者空腹采集静脉血3 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清液。采用美国贝克曼全自动生化分析仪检测血清Hcy水平，烟台艾德康全自动酶免分析仪检测Lp-PLA2水平。

2 结 果

2.1急性脑血管病患者MTHFR C677T基因型分布 328例急性脑血管病患者MTHFR C677T基因分为CC、CT、TT基因型，其中CC、CT、TT基因型频率分别为42.68%、41.77%、15.55%。通过Hardy-Weinberg遗传平衡检验方法计算出328例急性脑血管病患者CC、CT、TT基因型频率理论值分别为40.41%、46.32%、13.27%。同时病例组实际值与理论值吻合度良好(χ2=1.47，P>0.05)，样本基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。见表1。

表1 急性脑血管病患者MTHFR C677T基因型、 等位基因分布

2.2急性脑血管病患者MTHFR C677T 基因型在不同性别中的分布 按照性别对不同MTHFR C677T 基因型的急性脑血管病患者进行分组。210例男性患者中，CC基因型95例(45.24%)，CT基因型78例(37.14%)，TT基因型37例(17.62%)。118例女性患者中，CC基因型45例(38.14%)，CT基因型59例(50.00%)，TT基因型14例(11.86%)。MTHFR C677T基因型在男、女组间的分布差异无统计学意义(χ2=5.49，P>0.05)。

2.3急性脑血管病患者MTHFR C677T基因型在不同年龄中的分布 急性脑血管病CC基因型患者年龄为(64.23±12.12)岁，CT基因型患者年龄为(63.99±11.88)岁，TT基因型患者年龄为(60.06±12.66)岁。MTHFR C677T基因型在不同年龄患者中的分布差异无统计学意义(F=2.40，P>0.05)。

2.4急性脑血管病患者MTHFR C677T 基因型在不同临床诊断中的分布 78例急性脑出血患者中CC基因型29例(37.18%)，CT基因型34例(43.59%)，TT基因型15例(19.23%)。153例急性脑梗死患者中，CC基因型75例(49.02%)，CT基因型56例(36.60%)，TT基因型22例(14.38%)。97例TIA患者中，CC基因型36例(37.11%)，CT基因型47例(48.46%)，TT基因型14例(14.43%)。MTHFR C677T基因型在急性脑梗死组、急性脑出血组及TIA组中的分布差异无统计学意义(χ2=5.67，P>0.05)。

2.5不同MTHFR C677T 基因型急性脑血管病患者血清Hcy、Lp-PLA2水平比较 急性脑血管病TT基因型患者血清Hcy水平明显高于CC、CT基因型患者，3组间差异有统计学意义(Z=31.87，P<0.05)。其中TT基因型患者血清Hcy水平与CT、CC基因型患者比较，差异均有统计学意义(Z=15.14、11.62，P<0.05)。急性脑血管病3种不同基因型患者血清Lp-PLA2水平比较，差异无统计学意义(Z=1.16，P>0.05)。见表2。

表2 不同MTHFR C677T基因型急性脑血管病患者血清Hcy、Lp-PLA2水平比较[M(P25～P75)]

2.6不同急性脑血管病患者血清Hcy水平比较 急性脑出血组、急性脑梗死组、TIA组血清Hcy水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同急性脑血管病患者血清Hcy水平比较[μmol/L，M(P25～P75)]

2.7不同急性脑血管病患者血清Lp-PLA2水平比较 急性脑梗死组血清Lp-PLA2水平高于急性脑出血组和TIA组，TIA组血清Lp-PLA2水平高于急性脑出血组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同急性脑血管病患者血清Lp-PLA2水平比较[ng/mL，M(P25～P75)]

3 讨 论

急性脑血管疾病是多危险因素、多遗传因素参与的复杂疾病，如果能在疾病早期对其危险因素进行有效干预，可明显降低疾病的致残率及致死率。

本研究通过对328例急性脑血管病患者MTHFR 基因C677T 位点分型进行分析，发现C等位基因占63.57%，T等位基因占36.43%。MTHFR C677T 基因型经过Hardy-Weinberg遗传平衡检验差异无统计学意义(P>0.05)，表明样本在人群中具有代表性。同时，本研究结果还显示，急性脑血管病患者MTHFR C677T基因型在不同性别、年龄及临床诊断中的分布差异均无统计学意义(P>0.05)，因此，可排除性别、年龄及临床诊断对MTHFR C677T基因多态性分布的影响。

近年来，大量文献报道，急性脑血管病的发生及预后与血清Hcy水平密切相关，体内Hcy水平升高是脑血管病发生的独立危险因素，同时MTHFR C677T 基因多态性与高同型半胱氨酸血症呈显著相关[9-10]。MTHFR C677T 基因位点发生突变会出现野生型(CC型)、杂合突变型(CT型)及纯合突变型(TT型)3种基因型。MTHFR C677T基因杂合突变和纯合突变可使 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性分别降低30%和70%，关键酶活性降低，导致Hcy发生代谢障碍，使机体Hcy水平升高[11-12]。Hcy水平升高会直接影响血管壁弹力层和胶原纤维，破坏血管内皮细胞，Hcy氧化过程中产生泡沫细胞进而形成粥样斑块，促进低密度脂蛋白在单核细胞堆积沉淀，促进动脉粥样硬化，形成血栓。本研究结果显示，328例急性脑血管病患者中， MTHFR C677T的TT基因型患者血清Hcy水平明显高于CC及CT基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)，提示急性脑血管病患者MTHFR C677T 基因多态性与Hcy水平存在相关性。TT基因型患者体内MTHFR基因C677T位点C到T的突变，导致MTHFR酶活性降低，因此患者更容易出现高同型半胱氨酸血症，从而引发体内血管动脉粥样斑块及血栓的形成，增加急性脑血管病的发病风险。

在急性脑血管病的众多独立危险因素中，Lp-PLA2为一种新型的血管炎性标志物，它由成熟巨噬细胞和淋巴细胞合成分泌，受炎性介质调控。有研究表明，Lp-PLA2能促进心脑血管疾病的发生及动脉粥样斑块的形成，其水平与冠心病、缺血性脑卒中的严重程度高度相关[13-16]。3种不同基因型急性脑血管患者血清Lp-PLA2水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示MTHFR C677T基因多态性不影响Lp-PLA2活性。通过对不同急性脑血管患者Lp-PLA2水平分析发现，急性脑梗死组Lp-PLA2水平高于急性脑出血组及TIA组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示急性脑梗死患者体内Lp-PLA2水平及活性的升高，预示着Lp-PLA2通过促炎作用，破坏粥样斑块的稳定性，导致诱发血管梗死病变的风险加剧，进而增加急性脑梗死的发病率。

综上所述，MTHFR C677T 基因多态性是急性脑血管疾病的遗传易感因素，其中TT基因型所引发的高同型半胱氨酸血症，提示T等位基因是急性脑血管疾病独立危险因子。同时Lp-PLA2也是影响急性脑血管疾病发病的重要危险因素。因此，MTHFR C677T 基因多态性及Lp-PLA2水平对急性脑血管病的早期发现和预防具有重要意义，可以作为风险预测因子。但急性脑血管病是多种因素及遗传易感性共同促成的复杂疾病。研究MTHFR C677T基因多态性及Hcy、Lp-PLA2水平与疾病的相关性，还需要扩大样本量，寻找符合纳入、排除标准的健康参考样本，对多样本的包括饮食、环境、遗传等多种因素进行联合分析，从而为疾病的防治提供更科学合理的依据。

4 结 论

急性脑血管病MTHFR C677T基因型中，TT基因型患者Hcy水平较CT、CC基因型患者高，说明MTHFR基因 C677T位点C到T的突变，导致Hcy代谢障碍而引起Hcy水平升高。急性脑血管患者中，急性脑梗死组血清Lp-PLA2水平高于急性脑出血组与TIA组，说明血清Lp-PLA2水平的升高可加剧大血管的炎性病变，增加脑梗死发生的风险。