基于液相色谱-质谱联用技术的心肌缺血大鼠血清和心肌组织代谢组学

尹春园,孙明谦,金 龙,林 力,苗 兰,刘建勋*

(1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所,中药药理北京市重点实验室,北京 100091;2.北京中医药大学,北京 100029)

心肌缺血(myocardial isochemia)是由于心脏的血液灌注量降低,导致心脏的供氧减少,心肌能量代谢异常,不能支持心脏正常工作的病理状态[1]。随着社会经济的发展和人们生活方式的转变,我国心血管疾病患者人数逐年增加。目前,心血管病是城乡居民死亡原因的首位,且农村居民心血管病的死亡率逐年增加[2]。如何应用现代技术对心肌缺血的发病机制进行阐释,是中医药现代化研究的重要任务之一。

代谢组学(metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴组学技术,是系统生物学的重要组成部分,它通过检测来自体液或组织中的小分子代谢物,来实现在疾病的早期诊断和治疗检测过程中的重要作用[3,4]。代谢物作为基因的下游产物,能够最直接反映不同组之间的表型差异,从代谢层面上放大表达基因、转录、蛋白质层面的差异[5]。

本文利用液相色谱-四极杆轨道离子肼质谱对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导的心肌缺血大鼠进行心肌组织和血清的靶向代谢组学研究和生物标志物的分析,揭示与心肌缺血有关的代谢通路,探索其发病机制。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与实验动物

赛默飞UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国ThermoFisher Scientific公司);Q ExactiveTM组合型四极杆质谱仪(美国ThermoFisher Scientific公司);22 R高速离心机(德国Mikro公司);低温冰箱(美国Thermo公司);Mix-3000振荡混匀器(杭州米欧仪器有限公司);Mikro 220R台式高速冷冻离心机(德国Hettich公司)。

异丙肾上腺素盐酸盐(C11H17NO3·HCl,相对分子质量247.72,纯度高于99.0%,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸(HPLC级,美国Fisher Scientific公司,纯度99%)。

SPF级健康雄性SD大鼠16只,体质量200～220 g,购自北京斯贝福生物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2016-0002,合格证号11401500048859。饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级实验动物中心,室内温度20～23 ℃,湿度40%～60%,昼夜循环12 h。

1.2 心肌缺血大鼠模型的建立及分组

所有大鼠适应性饲养3天后随机分成两组:正常对照组(8只)和模型组(8只)。模型组背部皮下注射ISO造成心肌缺血,给药剂量为85 mg/kg,1次/天,两次注射给药时间间隔为24 h。

1.3 血清样本采集与处理

第二次注射ISO后,大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射10%(质量分数)水合氯醛麻醉后腹主动脉取血,常温下静置0.5 h于4 ℃以3 000 r/min离心10 min后取上层血清存放于-80 ℃冰箱以备后续血清指标检测和代谢组学进样处理。

取100 μL血清,加300 μL乙腈,混匀振摇1 min,于4 ℃以13 200 r/min离心10 min后取上清液检测。

1.4 组织样本采集与处理

按1.3节所述取血完毕后剪下大鼠心脏,分取100 mg缺血明显的心肌组织,转移至匀浆管中,加入钢珠、陶瓷珠高速振荡30 min制备匀浆液,匀浆后,向心肌组织中加入1 mL乙腈,混匀提取1 h,所有样本离心,离心条件为4 ℃、13 200 r/min、10 min,离心后取上清液检测。

1.5 模型药理指标

取1.3节中离心后的血清进行肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB)的测定。

各组大鼠血清CK活力按照CK测定试剂盒说明书操作,采用日本临床化学委员会(JSCC)标准化对应/国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)转化法对应计算大鼠血清CK的活性。各组大鼠血清的LDH活性按照LDH测定试剂盒说明书操作,用IFCC法检测大鼠血清的LDH活性。

各组大鼠血清中CK-MB活性按照CK-MB测定试剂盒说明书操作,采用免疫抑制法检测CK-MB含量。

1.6 色谱条件

BEH Amide色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相的组成:A为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的乙腈,B为含0.1%甲酸的水。梯度洗脱程序:0～6 min,20%B～50%B;6～9.5 min,50%B～20%B;9.5～12 min,20%B。柱温:50 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:1 μL。

1.7 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测,质量扫描范围m/z70～1 050,喷雾电压+3.7 kV,鞘气压力206 kPa (30 psi),辅助气压力69 kPa (10 psi),毛细管加热温度320 ℃,容积加热蒸发温度300 ℃。鞘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气,压力为1.5 mTorr。

1.8 数据采集与预处理

采用ThermoFisher Corporation Xcalibur 2.2 SP1.48 (Waltham,MA)软件执行亲水作用色谱(HILIC)-MS系统控制和数据采集,使用Skyline (64-bit,3.5.0.9319,MacCoss Lab,UW)软件对MS原始数据进行处理,通过标准品比对识别氨基酸和相关化合物,建立了40余种极性小分子成分靶向分析方法[6]。通过Skyline软件对各组样本进行定量分析,再将数据输入到MetaboAnalyst网站(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)进行归一化预处理,所得数据最后应用SIMICAP+12.0统计软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。

2 结果与讨论

2.1 药理指标评价

CK-MB与CK常被用作心肌损伤诊断的两项生化指标,可间接反映心肌细胞遭受ISO损伤的程度。如表1所示:与正常对照组相比,模型组大鼠血清中CK-MB活力极显著上升(p<0.01),表明大鼠心肌细胞明显受损;与正常对照组相比,模型组大鼠血清中CK活力极显著上升,LDH活力有上升趋势,但无显著差异。

表1 异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠的CK、LDH、CK-MB活性Table 1 CK,LDH,and CK-MB activity in rats with ISO-induced myocardial ischemia n=8)

CK:creatine kinase;LDH:lactate dehydrogenase;CK-MB:creatine kinase isoenzyme MB.

** Compared with control group,p<0.01.

图1 正离子模式下心肌缺血模型大鼠的(a)血清和(b)心肌组织样本的LC-MS基峰图Fig.1 LC-MS base peak chromatograms (BPC)of (a)a serum sample and (b)a heart tissue sample of rats with myocardial ischemia in positive ion mode

2.2 LC-MS分析结果

正离子模式下心肌缺血模型大鼠血清样本及心肌组织的基峰图见图1a和见图1b。对于LC-MS代谢组学研究,QC样本由等量的所有样本混合而成,所有样本均取20 μL,混合成为均一的QC样本。在代谢组学检测过程中,每进6个样本后进1个QC样本。从QC样本中选5个代表性的特征峰来评价整个实验的稳定性。在整个实验中,tR的波动<0.2 min,m/z的偏差<10×10-6(10 ppm),离子强度变化的RSD<20%。结果显示仪器的精密度良好,运行稳定,实验结果具有较好的重复性,在整个实验过程中由仪器系统误差引起的偏差较小,实验数据偏差小,结果稳定可靠。因此,本研究中所发现的代谢标志物含量差异能够真实反映样本组间本身的生物学状态差异。

2.3 模式识别分析

分别采用PCA和PLS-DA对正常对照组和模型组心肌组织匀浆液和血清中的代谢物谱进行分析,得到相应的散点分布图,见图2。各组样本呈现明显的分离效果,表明二者的代谢物谱存在明显差异。其中心肌组织的PLS-DA得分:R2(建模所用的主成分对原始数据的解释度)=0.988,Q2(模型的可预测度)=0.949;血清的PLS-DA得分:R2=0.968,Q2=0.873。

图2 大鼠心肌组织、血清样本的PCA、PLS-DA模式识别图Fig.2 PCA and PLS-DA pattern recognition of heart tissue and serum samples of ratsPCA:principal component analysis;PLS-DA:differentiation analysis of supervised partial least squares.

2.4 代谢通路分析

利用MetaboAnalyst平台对差异性代谢物进行代谢通路分析,心肌组织和血清样本的代谢通路见图3a和图3b。

图3 (a)心肌组织和(b)血清样本差异性代谢物的代谢通路Fig.3 Summary of (a)heart tissue and (b)serum pathway analysis with metabolomics

2.5 差异性代谢物的筛选

根据PLS-DA模型第一主成分变量重要性值(VIP)结果,并结合单因素方差分析的p值,以VIP>1.2,p<0.05为条件筛选具有差异表达的代谢物,最终得到18种组间差异代谢物,见表2。

2.6 差异代谢物相关代谢途径

与正常对照组比较,血清中鉴定出12个代谢差异性生物标志物,心肌组织中鉴定出12个代谢差异性生物标志物,二者共同含有的生物标志物为谷氨酰胺(glutamine)、羟脯氨酸(hydroxyproline)、鸟氨酸(ornithine)、甜菜碱(betaine)、核黄素(riboflavin)和牛磺酸(taurine)。

精氨酸(arginine)代谢相关:瓜氨酸(citrulline)和鸟氨酸是精氨酸代谢中的关键成分,它们的含量上升提示L-精氨酸-一氧化氮途径出现异常。肌酸酐(creatinine)与羟脯氨酸也间接参与了该途径的代谢。精氨酸是体内合成一氧化氮(NO)的前体,在本研究中的含量也出现了下降(p<0.05)。精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化下,生成NO与瓜氨酸,同时精氨酸还是内生性NO的唯一前体,该过程即L-精氨酸-一氧化氮途径[7]。值得注意的是,NO的作用具有双向性,能够维持血管张力、增强心肌的舒张功能并对心脏收缩功能有利,但在病理条件下,其亦可对心肌组织造成危害。例如iNOS(inducible NOS,iNOS)在正常条件下不存在,在心肌缺血条件下被诱导生成,产生大量NO,它可与超氧阴离子生成具有细胞毒性的过氧化亚硝基(ONOO-),对心肌造成损伤[8,9]。总之,精氨酸代谢途径的异常可能提示NO生成的异常及可能导致的氧化应激损伤,而这些损伤导致相关的内源性成分在心肌组织和血液中都呈现出不同程度的变化。

表2 大鼠心肌组织和血清的代谢差异性生物标志物Table 2 Differential metabolites in rat serum and heart tissue

* Change trend compared with control group.

能量代谢相关:在心肌缺血的过程中,能量代谢障碍是导致其进一步损伤的原因,缬氨酸(valine)为支链氨基酸,与能量代谢密切相关。缬氨酸为生糖氨基酸,其氧化产生的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的速率高于其他类型的氨基酸[10]。在心肌缺血的情况下,心肌能量的供给大幅下降。而缬氨酸等支链氨基酸可以为心肌提供能量补偿,这可能是缬氨酸下降的原因。血液中丙氨酸(alanine)的含量出现上升,而丙氨酸可通过糖异生的途径转化为葡萄糖,其含量上升提示丙氨酸-丙酮酸-葡萄糖循环的紊乱,机体氧化功能障碍进一步加重[11]。在心肌缺血模型中肉碱(L-carnitine)的含量出现上升,肉碱穿梭系统将脂肪酸转移到线粒体中,发生β-氧化,从而实现心脏的供能[12]。正常心肌能量供给60%～70%来自游离脂肪酸(FFA)氧化[13],而肉碱含量的变化提示这一系统出现了问题,正常心肌主要能量来源脂肪酸氧化受到了干扰。

作为高耗能的器官,心脏的能量代谢主要包括直接供能和磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)储能两种方式。直接供能是指心肌细胞摄取脂肪酸及葡萄糖在线粒体中通过氧化磷酸化产生大量的ATP来直接供能[14]。磷酸肌酸储能是指磷酸肌酶穿梭系统调控ATP和PCr之间的能量转换,在以下反应中形成磷酸肌酸:肌酸(creatine)+ATP←→PCr+二磷酸腺苷(ADP),即ATP的能量可被转移并存储于PCr中;当ATP需求增加时,CK同工酶可以快速地催化PCr与ADP的反应进而生成ATP和肌酸以供利用[15]。心肌缺血后能量的改变与PCr有关,它在高能量需求期间提供快速水解的ATP以供利用。研究表明,在心肌缺血的动物和患者中,不论心肌缺血的病因如何,PCr水平下降高达70%[16]。肌酐是肌肉中磷酸肌酸的分解产物,模型组中肌酐含量下降提示磷酸肌酸含量下降,符合心肌缺血能量代谢的物质特点。

牛磺酸是一种存在于心肌细胞中的含硫氨基酸,属于细胞保护剂。它通过调节离子通道和交换系统来降低Ca2+的超载,进而达到保护心肌的作用[17]。大剂量ISO可引起心率加快、心肌收缩力增强,心肌耗氧高于供氧,进而引发心肌缺血[18]。研究表明,经ISO诱导后的心肌缺血缺氧损伤与氧自由基有密切关系,心肌缺血时,大量氧自由基产生,破坏膜结构,致膜通透性增加,造成细胞Ca2+内流和Ca2+超载现象。牛磺酸可通过保护膜脂免受自由基引起的过氧化、抑制Ca2+超载来保护缺血心肌[19,20]。在本研究中,血清和组织中均检测到牛磺酸水平的下降,牛磺酸被大量消耗,表明心肌和血液中牛磺酸的代谢都出现了障碍,心肌中的Ca2+超载较为严重,心肌细胞损伤较为严重,血液中的含量也出现下降,提示对这一损伤难以进行全面的系统调节。

谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate)均属于谷氨酰胺和谷氨酸代谢途径,且两者的含量都出现了下降,尤其谷氨酰胺在心肌和血清中的含量都出现了下降。谷氨酰胺是一种主要由骨骼肌和肝脏产生的氨基酸,在细胞中占碳和氮代谢的绝大部分[21]。文献报道谷氨酰胺可以通过抑制炎症反应通路核心介质NF-κB的激活,来减少各种炎症因子的生成,进而减轻炎症因子对心肌的损伤,达到保护心肌的作用[22],同时谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要物质,而谷氨酰胺是其主要来源。谷胱甘肽系统是体内细胞减少氧化应激的主要机制之一。谷氨酰胺能够通过诱导谷胱甘肽的合成保护心肌细胞免受氧化应激的损伤,从而有利于缺血再灌注损伤后心肌细胞的恢复[23]。其在心脑血管疾病中亦被研究证明具有明显的抗氧化和清除自由基的作用,对心肌缺血具有保护作用[24]。本研究中,谷氨酰胺含量的下降,可能与心肌缺血中氧化应激压力增大和炎性反应密切相关。

3 结论

本文利用代谢组学的分析手段检测异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠血清和心肌组织代谢物的变化,通过多元统计分析,确定了牛磺酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸等18个差异代谢物,这些代谢物主要与能量代谢、精氨酸代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢等途径有关,揭示了心肌缺血的发病机制,为临床早期疾病预测和诊断提供了依据。