阿尔茨海默病秀丽隐形杆线虫Aβ 模型的建立

王饶琼，王立胜，白雪，李双阳

(西南医科大学附属中医医院，四川 泸州)

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，又称老年痴呆，是一种渐进性神经退行性疾病，目前已经成为第三大致死性老龄化疾病[1]。AD 逐年升高的发病率，使得传统治疗药物无法满足患者的需求，新疗法、新药物亟待被研究[2]。缺乏合适的动物研究平台是神经退行性疾病研究受到阻碍的主要因素之一[3]。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans) 作为一种新型模式生物以其花费少、生命周期短、结构简单等优势，逐步取代传统动物模型在神经系统研究领域发挥作用[4]。现阶段已被建立的阿尔茨海默病秀丽隐杆线虫模型多为转基因模型：Aβ 模型和tau 模型[5]，本文章主要研究阿尔茨海默病秀丽隐杆线虫Aβ 模型的建立。

1 A 材料与方法

1.1 实验动物及分组

C.elegans(N2) 野生型秀丽隐杆线虫120 条、E.coli OP5O，由西南医科大学附属中医医院国际中葡研究中心提供。随机分为空白组和实验组各60 条，实验组建立Aβ 表达的转基因线虫模型，空白组建立无Aβ 表达的线虫模型。

1.2 线虫的培养与保存

大肠杆菌OP50 的冻存菌种接种于LB 液体培养基(Luria-Bertani)，用接种环蘸在培养基表面划线，37℃恒温培养箱培养12-14h；挑取一个LB 固体培养基上的单菌落接种至LB 液体培养基中，放入恒温振荡器中，37℃，150rpm，培养12h；凝固后NGM 培养基均匀涂布OP50 菌液，置于37℃恒温培养过夜。将从-80℃冰箱中取出的冻存线虫，短时间快速融化后，用高速离心机离心去除上清，用无菌的M9 缓冲液重悬虫体后转移到新的涂有OP50 菌苔的NGM 平板，将复苏后的线虫转移至新的NGM 平板继续培养。

1.3 模型的建立

1.3.1 建立Aβ1-42 嵌合转基因

β-(1-42) 肽编码基因分为三个步骤。矢量ppd50.52 人工信号肽编码序列的引物扩增，采用SP-up (5'-CGGGATTGGCCAAAGGACCC-3')and SP-down(5'-CCCGGTACCTGCTGGTGCCAGAAAGAT-3')，裂 解Nhe I 和Kpn I 限 制 性 内 切 酶，并插入NheI 和KpnI 之间的独特位点矢量pPD49.26，从而构建pCL2。这个过程会产生一个重组的信号肽。通过利用引物β1-42-up(5'-GGGGGTACCGATGCAGAATTCCGACATGA-3') 和β1-42-down(5’- CCCGAGCTCACGCTATGACAA—CACCGCCAA-3')，从人类的Aβ 淀粉样前体蛋白cDNA 的克隆p4t4b(29) 扩增产生146 bp 的片段编码β-(1-42)( 包括人工终止密码子)，裂解Kpn I和Sac I，并插入独特的Kpn I 和Sac I 位点pCL2，产生pCL3。信号肽/ β-(1-42)微基因片段通过与Nhe I 和Sac I 分解从该质粒中移除，插入Kpn I 和Sac I 之间独特位点矢量pPD30.38，从而构建pCL12。β-(1-42)的序列微基因经双脱氧测序确定(唯一的编码链)。

1.3.2 显微镜注射法将性腺引入线虫

转基因是由显微注射性腺导入线虫。标记质粒PRF4 [rol-6(su 1006)] 和上述的结构( 每个质粒at ≈100ng/ul) 被注射进him-5(el490) 的动物，恢复Roller 转基因后代。通过选择Roller 标记表型来建立和维持传输线。一个66 铯源的包含有7000rad(1rad= 0.01Gy)γ 射线的染色体外基因阵列的照射线，可以使含有染色体整合的转基因菌株恢复，然后通过标记转基因的100%透光率对辐照动物后代进行筛选。最后对大量公认的整合线进行免疫组化，证实嵌合结构的完全透过率。

1.4 模型的检测

1.4.1 躲避反应检测实验

连续3 天同一时间予以身体轻触、鼻尖轻触、身体重击以及培养基震动，观察线虫躲避反应；3 天后撤出刺激。

1.4.2 温度感知记忆实验

将空白组与对照组的线虫在20℃放在有和无食物的环境下分别培养，然后转移到有15℃、20℃、25℃不同温度梯度培养皿中时，对比线虫在不同温度梯度的等温线上的分布情况；每隔2h 做一次计数观察。

1.5 统计学方法

统计学处理：本实验用统计软件SPSS 22.0，定量资料用表示；各组组间的比较，用单因素方差分析；每组组间的两两比较，用LSD(least significance of difference，最小差异显著法)法，检验水准α=0.05，当P＜0.05 时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 躲避反应检测实验

实验组：前三天刺激线虫身体后半部分会使它们加速向前运动，反之刺激其身体前半部分，它们会产生后退运动；敲击培养基、鼻尖轻触线虫会反向运动或者后退；3 天后，撤出刺激，同一时间53 条线虫出现同样运动改变；空白组线虫前后均无运动改变；差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 温度感知记忆实验

2.2.1 有食物培养的线虫

实验组54 条线虫转移到20℃的温度分布线上，4 条转移到15℃的温度分布线上，2 条转移到25℃的温度分布线上，差异具有统计学意义(P＜0.01)；空白组17 条转移到15℃的温度分布线上，20 条转移到20℃的温度分布线上，23 条转移到25℃的温度分布线上，差异无统计学意义(P＜0.01)；实验组与空白组对比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.2.2 无食物培养线虫

实验组线虫30 条转移到15℃温度分布线上，29 条转移到25℃的温度分布线上，1 条转移到20℃的温度分布线上，差异具有统计学意义(P＜0.01)；空白组无明显变化，但与实验组相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

阿尔茨海默病是是一种中枢神经系统退行性疾病，多发病于老年人。其主要特征表现为记忆能力的减弱、认知能力的逐步下降以及行为障碍[6]。主要的病理学特征是大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变，细胞内神经原纤维缠结和细胞外老年斑沉淀[7]。其中β 淀粉样蛋白(Aβ)为沉淀的主要成分，是由β 前体蛋白(APP)通过蛋白酶形成的多肽片段途径裂解成长度为39-43个氨基酸的片段[8]。淀粉样前体蛋白APP 存在于包括神经原纤维在内的多种细胞膜表面，是一类具有膜受体蛋白样结构的跨膜蛋白，APP 蛋白经β-γ-分泌酶水解后在大脑中产生两种主要成分，名为Aβ-40 和Aβ-42 的蛋白小片段。其中Aβ-40 较Aβ-42有更为显著的可溶性，因此，Aβ-42 是作为淀粉样蛋白斑的主要成分[9]。Aβ 单体在体外聚合形成不溶性的蛋白聚合物，沉积于神经元表面，破坏了细胞内环境的稳定，引发神经毒性，造成神经递质释放减少，大量神经元和轴突功能失调，最终导致AD 症的发生[10]。由于秀丽隐杆线虫中不存在β-分泌物的类似基因，转入人的APP 基因后不能自行产生Aβ，故目前建立的模型主要是转Aβ 基因模型[11]。

秀丽隐杆线虫是从土壤中分离的一类无毒无害，结构简单，可以独立生存的小型线虫。秀丽隐杆线虫培养简单，在实验室条件只需要配置NGM 平板，喂食大肠杆菌OP50 就可以保证其生长发育[12]。它在神经生物学的研究方面，线虫也是一个不可替代的真核生物模型，拥有简单完整的神经系统[13]。其感受系统不仅能检测到食物、宿主、配偶的存在，还能帮助其及时发现并躲避危险[14]。本实验结果显示，将线虫在20℃的环境中培养，当把它们转移到不同温度梯度的环境中时，它们趋向于分布到其培养条件的温度环境。并且，将线虫在一个温度中饥饿一段时间后放置到温度梯度中时，它们则会避开饥饿时的温度。并且触觉等刺激也可以引发线虫的躲避行为。表明，线虫的神经系统虽然相对简单，但却对温度、机械、化学等外界刺激具有灵敏的感知、反应与记忆能力。

综上所述，可以通过线虫Aβ1-42 转基因，建立阿尔茨海默病秀丽隐形杆线虫Aβ 模型。，为后期阿尔茨海默病的研究和新药开发打下基础，对理解神经退行性疾病发生发展规律和尽早干预具有重要意义。