地中海贫血实验室诊断技术最新进展

陈栋，彭小媚，林永恩，陈善昌

(广西贺州市人民医院检验科，广西 贺州)

0 引言

地中海贫血(简称地贫)疾病分为输血依赖型地中海贫血和非输血依赖型地中海贫血。该分类基于患者的临床严重程度，确定他们是否确实需要定期输血才能生存。地中海贫血的两个主要类别是α 和β 地中海贫血，然后将其分为其他子类别，这取决于珠蛋白链的缺陷和潜在的分子缺陷，目前尚无有效的治疗方法。地贫最常见于东南亚和南亚，中东，然而，鉴于持续的迁徙，地贫现在在北欧和北美也变得越来越普遍。就我国患病情况来看，地贫在广东、广西、四川多见，长江以南各省区有散发病例，北方则少见。

因此，使用准确、高效、适用的地贫筛查和诊断方法，将有利于临床对该病的诊断和适当治疗，并且还能引导患者进行婚前检查及后面的产前诊断，避免重症地贫患儿的出生，起到预防及优生优育的作用，对社会人口健康发展有着重要指导意义。目前实验室诊断技术主要包括地贫的筛查方法和基因诊断技术。正确的实验室诊断技术对于鉴别不同形式表征的地贫至关重要，对预防，诊断和治疗具有重要意义。本文就地中海贫血实验室诊断技术最新进展进行综述。

1 地中海贫血筛查方法

1.1 血红蛋白电泳技术

血红蛋白是由两对多肽链组成，每一条链含有血红素和络合铁原子的卟啉，血红蛋白的蛋白称为珠蛋白。血红蛋白的结构，分子特性不同是由于其肽链氨基酸顺序和性状改变造成。血红蛋白(Hb)电泳是最常用的评估方法。不同的血红蛋白(例如HbA，HbA2 和HbS)具有不同的电荷，这使它们通过电场在凝胶中以不同的速度运动。Hb 蛋白中的畸变会改变其电荷，这可以通过其在凝胶中迁移速度的变化来识别。在碱性条件下，以琼脂糖凝胶电泳方式进行，电泳待凝胶干燥后，肉眼可直接判断条带有无异常。运用扫描仪检测可准确定量分析电泳条带的异常情况。有报道称，当血红蛋白HbA2＜2.5%时，则高度怀疑是α 地贫基因携带者，如果发现了HbH 包涵体，则为中间型α 地贫。其余类型增多则无法直接判断，但可作为β 地贫的排除性诊断[1]。

1.2 血液学检查

地贫作为隐性疾病，通过血液学检查来识别地贫的携带者是必不可少的。α 或β 地中海贫血携带者( 杂合子) 均表现为小细胞低色素性贫血，红细胞形态和网织红细胞计数有助于将地中海贫血患者与其他血液病患者区分开来，而最常见的缺铁性贫血是最需要鉴别诊断以排除的[2]。在测定铁蛋白或原卟啉锌之后，调查家族史可能为地中海贫血的实验室诊断提供有用的信息[3]。血液学参数包括血红蛋白含量、平均血红蛋白含量、红细胞体积分布宽度、平均红细胞体积及平均血红蛋白浓度等。每当检测到缺铁时，在明确诊断之前，必须先补充铁后再重复血液学参数检测。在大多数地中海贫血携带者中都可以检测到红细胞的形态变化：最典型的变化是小红细胞增多症，色素减退和异红细胞增多症(红细胞大小和形状的变化)。

1.3 高效液相色谱技术

高效液相色谱技术(HPLC)是采用分离率高的离子交换层析法进行自动快速血红蛋白分析的。最近，阳离子交换高效液相色谱已成为检测许多Hb 亚型的流行方法，是一种灵敏度高，特异性强，重复性高的电泳替代方法，故HPLC 被国际地贫协会推荐作为β 地贫常规筛查方法。其检测结果可对血红蛋白组分中的HbA2，HbF 准确定量，同时还能检测到HbBart’s，HbH，提示患者有α 地贫，对β 地贫也可以作出准确的诊断。HPLC 同时还可对地贫基因无法查出的多种异常血红蛋白病作出诊断。

然而，尽管地贫的高效液相色谱技术有逐渐被基因诊断所替代的趋势，但在实验室条件缺乏、非典型突变或是复杂类型的地贫患儿的诊断中，高效液相色谱技术对地贫的诊断依然具有非常重要的地位[4]。

2 地中海贫血的基因诊断技术

依据分子生物学基础的基因诊断技术，正在临床被广泛地应用。研究表明约5% 的β 地贫及约95% 的α 地贫是由于基因缺失引起的。DNA 分子诊断技术已广泛应用于地中海贫血。当前，有许多不同的基于PCR 的技术可用于诊断已知的珠蛋白基因突变，以及用于鉴定未知突变的其他方法。传统的印记杂交技术，是用显影技术显示不同的DNA 位置及其含量大小，从而判断基因片段的缺失与否，可作为α 地贫基因缺失型诊断的金标准[5]。但由于操作繁琐，检测时间长已逐渐被取代。目前地贫检测最常用的方法是聚合酶链式反应技术[6]。

2.1 以PCR 为基础的分子生物学基因诊断技术

2.1.1 反向斑点杂交技术

反向斑点印迹技术已被广泛使用，其中扩增的DNA 与固定在尼龙条上的一组突变特异性探针杂交，通过分子杂交及显色反应，观察膜条信号的有无，判断探针与产物的杂交与否，从而确定待检样本的基因型。对于β 地中海贫血突变，反向斑点印迹技术更是在临床被广泛使用。

2.1.2 裂隙聚合酶链反应

裂隙聚合酶链反应(gap polymerase chain reaction，Gap-PCR)技术已广泛应用于α 地贫的检测，其特点是高特异性和高灵敏度，在大样本、多突变位点筛查上比传统非均一性方法更方便、性价比更高，相比定量探针法突变分析和其他类型快速突变分析法，应用面更广，成本更低[7]，其原理是两端设计一对引物，利用引物间距过远，超出有效扩增范围而不能生成扩增产物。大片段缺失的存在会使断端连接，上下游引物靠近，生成特定扩增产物[8]。由于α珠蛋白基因簇内的序列同源性很高，因此α 珠蛋白基因簇中的序列扩增比β 珠蛋白基因簇中的扩增困难。α 地中海贫血主要是由于不同长度的缺失所致，可以通过Gap-PCR 优先检测。已经公开了引物序列以诊断几种α+或α°[9-11]，近年来该检测技术广泛应用于临床。欧阳红梅等[12]对云南少数民族地区新生儿α 地贫基因，以Gap-PCR、荧光定量PCR 熔解曲线法检测，携带率为9.0%。唐笑等人[13]对湖南地区的7914 例样本采用Gap-PCR 法进行α 地贫基因缺失检测，检出率为17.44%。戴庆福等[14]对7823 例血常规指标异常的病人采用Gap-PCR 检测3 种缺失型α 地贫，携带率为15.66%。Gilad 等[15]也选择Gap-PCR 检测常见的缺失型α 地贫，该方法具有较高的检出率，对临床诊断意义重大，被实验室广泛应用检测。Gap-PCR 法还能诊断β 地贫大片段基因的缺失。已知有200 多种β 地贫突变，其中大多数是单核苷酸取代，插入或短缺失，大多数可以通过Gap-PCR 诊断出来[16]。然而，Gap-PCR 的结果判读需电泳，易造成污染，且繁琐，不适于检测大量样本[17]。

2.2 基因芯片技术

地中海贫血基因诊断芯片是一种基于芯片检测地贫基因突变的新技术，它能同时检测α 与β 地贫基因突变类型。基因芯片采用微量点样或是光导原位合成等方法，将生物分子作为探针固定于支持物表面，然后与已标记的待测分子进行杂交，通过激光共聚焦扫描对杂交信号的强度进行检测，从而对该分子的数量和性质进行分析。该技术能准确快速地从分子水平诊断该疾病，在地贫的基因诊断方面应用前景广阔。地中海贫血基因芯片诊断体系，DNA 测序的改进和成本的降低使得基因芯片在许多实验室中得到了最广泛的应用，仅用病人一点血液标本，就可以分析出基因的确切核苷酸序列或所评估的基因区域，可以准确判断病人是否携带地贫致病基因，准确快速地对中国人常见的8 种地贫突变进行分子学诊断。

2.3 多重连续探针扩增技术

多重连续探针扩增技术是依赖探针来进行的扩增技术，可检测约50 个位点的拷贝数变异[18]。其原理是把目的基因复制到探针上，再用引物扩增捕获片段，再对片段进行电泳分析得出结果。引入多重连续依赖性探针扩增，由于它的灵敏性和可靠性，现在可以使用该方法代替Southern 印迹，而无需使用放射性检测[19]。

2.4 高通量测序

在Sanger 测序时代之后，下一代测序(NGS)代表了测序技术的新原理。一次分析即可将测序能力从几百个碱基对增加到几千个。NGS 基于克隆扩增的DNA 分子的大规模并行测序，再加上足够的计算能力和用于高效数据分析的适当软件，已将遗传学诊断以可承受的价格引入了临床实践[20]。它可以应用于整个基因组，整个外显子组和到基因组的特定目标区域。目前，在文献中，没有关于用这种方法对球蛋白基因进行测序的数据。只有一个商业测序小组可用，报告包括HbB 和HbA1 基因。

NGS 的最关键步骤是用于DNA 捕获的探针集的实验设计：α和β 簇中基因之间的高度同源性使NGS 治疗地中海贫血的方法非常困难，耗时且昂贵，NGS 的另一个关键点是，它可用于检测单核苷酸取代，插入或小缺失，但对于其他类型的基因组变异而言却不那么准确。尽管现在生物信息学的研究也正在研究用于检查是否存在复杂的重排的工具，但现在遗漏了大的缺失或三联，尤其是在α 地中海贫血的情况下，这使整个过程完全无用。

总之，重要的是要强调，不需要DNA 分析球蛋白基因突变即可诊断大多数携带者状态。建议了解TDT 的诊断，了解父母突变，以及在NTDT 病例中，不同球蛋白基因缺陷的共存性可能导致不同的表型表达。

由于存在轻度突变或α 和β 地贫相互作用，即使通过家庭血液学评估，有些病例在血液学和临床上也难以诊断；因此，在这种情况下，在开始治疗之前进行分子分析很方便。

绒毛膜绒毛DNA 的分析是产前诊断的方法，根据实验室的设施和专业知识，所使用的方法与突变检测的方法相同。产前诊断的必要步骤是切除任何母体组织，因为母体残留组织的存在可能会导致诊断错误。为了排除母体污染，通过PCR 检测胎儿和父母DNA 样品中的短串联重复序列或可变数目的串联重复序列是必不可少的[21]。

3 小结

地中海贫血是最常见的隐形遗传病，目前无有效的治疗方法，大部分靠输血为生，不仅加重患者的家庭负担，还影响人类素质的优生优育。不过有报道称，目前造血干细胞移植(HSCT)仍是该疾病的唯一综合治疗方法，在重型地中海贫血中，与HLA 匹配的家庭供体仍被认为是金标准的造血干细胞移植(HSCT)，在骨髓或脐带血移植后均取得了优异的效果[22]。但费用昂贵，且难找到匹配的供体，不是一般家庭所能承受的。

目前实验室检测地贫比较常见的技术是血红蛋白电泳，Gap-PCR 和反向斑点杂交技术，但不管是哪一种方法，都有它的局限性，存在漏检等，影响检出率。而多重连续探针扩增技术、基因芯片技术、高通量测序等技术成本较高，不适于大规模样本，但随着科学技术进步在不断的完善当中，相信这些技术能发展的更好，同时我相信不久的将来会有更好的地贫检测技术出现，从而更好的服务患者，造福人类。