肿瘤相关成纤维细胞调控肿瘤免疫炎症微环境的研究进展

赵伟光，刘志宏

上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科，上海200080

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由细胞外基质（extracellular matrix，ECM）及肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞等在内的多种细胞成分组成。研究[1]认为，TME 在肿瘤增殖、侵袭、转移、血管生成、代谢、免疫抑制及药物抵抗等方面发挥重要作用。

CAFs 是处于活化状态的一类异质性细胞，可来源于组织中静息状态的成纤维细胞、周细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），或通过上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、内皮-间质细胞转化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）而来。与正常成纤维细胞相比，CAFs 具有明显不同的形态学和生物学特性。作为TME 的重要组成部分，CAFs能够分泌大量可溶性分子，以旁分泌的方式作用于TME中的其他细胞[2]。TME 的另一大细胞群——免疫细胞与CAFs 协同作用，使TME 呈现为免疫抑制微环境，为肿瘤细胞的生长及免疫逃逸提供了有利条件[3]。因此，大量研究开始关注于CAFs 在诱导肿瘤起源及调控肿瘤免疫中所扮演的角色，并试图以CAFs 为靶点找到治疗肿瘤的新策略。该文就CAFs 参与肿瘤免疫炎症微环境的分子机制及靶向CAFs 的免疫治疗做一综述。

1 CAFs 的分子标志物

1.1 α-平滑肌肌动蛋白

α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是CAFs 常见的分子标志物。其通过微丝束和应力纤维调节成纤维细胞收缩，在伤口愈合中发挥重要作用。根据α-SMA 表达量的不同，Öhlund 等[4]发现胰腺癌组织中存在FAP+α-SMAhigh的肌性CAFs（myofibroblastic CAFs）和α-SMAlowIL-6high的炎性CAFs（inflammatory CAFs）。由于肌成纤维细胞在肿瘤组织中的含量更高，α-SMA 被广泛用于标记CAFs[5]。

1.2 成纤维细胞活化蛋白

成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）是膜结合丝氨酸蛋白酶家族的一员。传统观点认为，FAP 与组织修复、纤维化及ECM 降解有关。已有证据表明，FAP 在90%以上的上皮肿瘤中高表达[6]，因此，大量的研究将FAP 作为CAFs 的分子标志物。然而Li等[7]通过单细胞测序发现，FAP 只在一些特定的CAFs 亚群中表达，在另一些亚群中则完全不表达。这一现象可能与CAFs 来源的异质性有关。

1.3 其他

由于CAFs 具有高度异质性，目前尚缺乏特异性的分子标志物。微纤丝相关蛋白5（microfibril-associated protein 5，MFAP5）、胶 原 蛋 白α-1（Ⅺ）链（collagen type Ⅺ α-1 chain，COL11A1）、肌腱蛋白C（tenascin-C，TN-C）等虽然可用于标记CAFs，但较少使用；血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、波形蛋白（vimentin）广泛表达于成纤维细胞，也有研究将其用于CAFs 的标记[8]。与α-SMA 不同，FAP和PDGFR 表达在细胞表面，可用流式细胞技术筛选其阳性表达的细胞，进行细胞功能研究。CAFs 不具备内皮细胞或上皮细胞的特征，可使用CD31/血小板内皮细胞黏附分子1（platelet and endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1）、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）及上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）作为CAFs 的阴性标志物[5,8]。基于CAFs 的高度异质性，选用多种分子标志物并结合形态学特点将有助于CAFs 的识别。

2 炎症微环境介导CAFs 与肿瘤细胞间的交互对话

CAFs 与肿瘤细胞之间的作用是相辅相成的。在一定条件下，CAFs 诱导肿瘤的起源和肿瘤细胞增殖，而肿瘤细胞也可促进CAFs 的产生和激活。在肿瘤的发生和发展中，究竟哪种细胞起先导作用，目前尚无定论。

炎症是肿瘤的重要标志之一，在促进CAFs 形成及调控CAFs 活性的过程中发挥着重要作用。肿瘤细胞可分泌肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、IL-8、巨噬细胞迁移抑制因子（microphage migration inhibitory factor，MIF）等细胞因子，参与形成肿瘤炎症微环境[9]。研究[10]表明，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和IL-6可以调节成纤维细胞的侵袭活性。体外实验[11]证实，胰腺癌细胞产生的IL-1β 通过激活IL-1 受体相关激酶上调CAFs 细胞内核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路。乳腺癌细胞分泌的TNF-α 和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导纤维细胞中基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）的表达，进而选择性降解Ⅳ型胶原纤维和层粘连蛋白，促进肿瘤增殖和转移[5]。

活化状态的CAFs 通过释放大量生长因子和炎症因子维持其活化表型，而炎症环境又是肿瘤发生的一个启动因素[12]。来源于CAFs 的IL-6 和TGF-β1 起到促进EMT 及肿瘤细胞增殖的作用[13]。IL-6、抑瘤素M（oncostatin M， OSM）、LIF 等IL-6 细胞因子家族通过刺激信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）扩增肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）[14]。CSCs 通常保持在静息状态，参与化学治疗和放射治疗抵抗。由此可见，IL-6 既可由肿瘤细胞产生，上调CAFs 活性，也可由CAFs 分泌，调控肿瘤干性及肿瘤细胞增殖，两者之间存在交互对话。除此之外，CAFs 分泌的外泌体能够过表达TGF-β1，通过Smad 信号通路提高肿瘤的侵袭能力[15]。从黑色素瘤组织中分离出的CAFs 能够分泌MMPs，裂解表达在肿瘤细胞表面的自然杀伤细胞2族成员D（natural killer group 2 member D，NKG2D）的配体主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关蛋白A（major histocompatibility complex class Ⅰchain-related protein A，MICA）和MICB，降低黑色素瘤细胞对自然杀伤细胞（natural killer cells，NK 细胞）的敏感性[16]。

3 CAFs 对免疫细胞的调控作用

3.1 CAFs 对固有免疫细胞的调控作用

参与肿瘤免疫的固有免疫细胞主要有肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）、肿瘤相关中性 粒 细 胞（tumor-associated neutrophils，TANs）、NK 细胞、髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），及树突状细胞（dendritic cells，DCs）（图1）。由于DCs 的抗原提呈作用与T 细胞功能的发挥密切相关，其研究进展将在适应性免疫细胞中介绍。

CAFs 招募免疫细胞的过程主要通过CC 类趋化因子配 体（CC-chemokine ligand，CCL）、CXC 类 趋 化 因 子配体（CXC-chemokine ligand，CXCL）及集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）实现。TAMs 可分为M1型和M2 型，前者发挥抗肿瘤作用，后者则促进肿瘤进展。CAFs 释放CXCL12/基质细胞衍生因子（stromal cellderived factor 1，SDF1）、M-CSF/CSF-1、IL-6 和CCL2/单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），募集单核细胞至肿瘤微环境，并诱导单核细胞向M2 型巨噬细胞分化，发挥免疫抑制效应[17]。TANs 与肿瘤预后不良密切相关。与TAMs 相似，TANs 也可分为抗肿瘤的N1 型和促肿瘤的N2 型。CAFs 是TGF-β 的重要来源，当TGF-β 被阻断时，TANs 表现为N1 型，起到杀伤肿瘤细胞的作用；当TGF-β 水平较高时，TANs 表现为N2 型，抑制CD8+T 细胞的功能[18]。NK 细胞通过细胞毒性作用参与早期免疫应答，并分泌细胞因子，促进抗原提呈细胞的成熟，强化适应性免疫应答。在多种肿瘤中，CAFs 可通过分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和吲哚胺-2, 3-双加氧酶（indoleamine-2, 3-dioxygenase，IDO）下调NK 细胞表面激活受体NKp30、NKp44、NKG2D、穿孔蛋白以及颗粒酶B（granzyme B，GraB）的表达，削弱NK 细胞对肿瘤的杀伤作用[17]。MDSCs 是一类来源于骨髓的异质性细胞，是DCs、巨噬细胞和粒细胞的前体，发挥重要的免疫抑制功能。CAFs 分泌IL-6激活STAT3 通路，募集单核细胞并使其分化为MDSCs，抑制T 细胞功能，形成免疫抑制微环境[19]。Vinit 等[20]发现抑制集落刺激因子1 受体（colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R）和CXC 类趋化因子受体2（CXCchemokine receptor 2，CXCR2）可以降低肿瘤组织中TAMs 和 多 形 核MDSCs（polymorphonuclear myeloidderived suppressor cells，PMN-MDSCs）的比例，阻碍肿瘤细胞的生长。

3.2 CAFs 对适应性免疫细胞的调控作用

DCs 是参与抗原提呈的主要细胞，能够激活T 细胞介导的抗肿瘤免疫。在CAFs 分泌的TGF-β 作用下，DCs 下调抗原提呈所需的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC） Ⅱ类 分 子 及CD40、CD80、CD86 等共刺激分子[17]。从肺癌组织中分离的CAFs 可以表达色氨酸-2, 3- 双加氧酶（tryptophan-2, 3-dioxygenase，TDO），促进犬尿氨酸中色氨酸的降解，从而抑制DCs 的分化和功能[21]（图1）。

CD8+T 细胞通常指细胞毒性T 细胞（cytotoxic T cells，CTLs），是杀伤肿瘤的关键细胞。CAFs 对CTLs 的影响主要包括2 个方面：①抑制CTLs 募集。②直接诱导其死亡。Kato 等[22]检测了CAFs 与结肠癌细胞共培养条件下肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）的含量，结果发现FoxP3+TILs （Tregs）含量增高而CD8+TILs（CTLs）含量降低，其原因在于CAFs 分泌了大量的IL-6。而CAFs 来源的CXCL12 能够限制T 细胞迁移至肿瘤组织[23]。此外，CAFs 还可通过程序性细胞死亡配体2（programmed cell death 1 ligand 2，PD-L2）和Fas 配 体（Fas ligand，FASL）杀 死CD8+T 细 胞[24]，TGF-β 则通过抑制B 细胞淋巴瘤 2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的表达促进CD8+T 细胞死亡[25]（图1）。

调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）参与免疫耐受的形成。CAFs 通过IL-1β/CCL22/CC 类趋化因子受体4 （CC-chemokine receptor 4，CCR4）轴募集Tregs[26]（图1）。 Costa 等[27]发现，在乳腺癌中CAF-S1 亚型可以诱导Tregs分化和活性上调，但CAF-S4 亚型未表现出该能力。因此，不同亚型的CAFs 对Tregs 的调节作用可能不同。研究[28]发现，在小鼠胰腺癌模型中消除Tregs 既没有改善肿瘤微环境的免疫抑制状态，也没有减缓肿瘤的进展。该研究发现Tregs 是TGF-β 的关键来源，而纤维细胞上广泛表达TGF-β 的受体TGFR，Tregs 的缺失使得纤维细胞群发生重组，SMAhigh肌性成纤维细胞数量明显下降，重组后的纤维细胞群分泌CCL3、CCL6、CCL8 并募集髓系细胞，促进免疫抑制微环境的形成，为肿瘤发生提供条件。这一研究结果使得传统观点受到挑战，同时也表明肿瘤是一个高度复杂的复合体，目前人们对肿瘤微环境的认识仍很匮乏。

除了影响CTLs 参与的免疫应答，CAFs 还可通过辅助性T 细胞（helper T cells，Th 细胞）抑制CD8+T 细胞功能。Th 细胞通常为CD4+T 细胞，主要包括Th1 和Th2；Th1 细胞参与细胞免疫，促进CTLs 的杀伤作用，而Th2 细胞为肿瘤生长营造适宜环境。CAFs 能够分泌TNF-α、IL-1β、胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）并诱导Th2 细胞分化[29]（图1）。在乳腺癌模型中，针对FAP+CAFs 的 DNA 疫苗促使Th2 细胞向Th1 细胞转化，提高IL-2 和 IL-7 的表达水平，进而抑制TAMs和Tregs 的功能，并激活CTLs[30]。Elyada 等[31]应用单细胞测序技术发现一种表达MHC Ⅱ类分子的抗原提呈CAFs（antigen-presenting CAFs），但其缺乏诱导T 细胞增殖的共刺激因子，因此该CAFs 表达的MHC-Ⅱ类分子可能作为诱饵受体介导CD4+T 细胞失活或转化为Tregs。

4 以CAFs 为靶点的免疫治疗

4.1 直接靶向CAFs

靶向CAFs 的实现依赖于其特异性抗原的表达，FAP因表达在CAFs 表面而被广泛应用。在小鼠原位注射乳腺癌细胞模型中，口服靶向FAP 的DNA 疫苗能够显著抑制血管新生、肿瘤生长和转移[32]。其疗效得益于抑制Ⅰ型胶原的产生并招募更多的CD8+T 细胞。一种共价偶联DM1（微管蛋白抑制剂）的FAP 单克隆抗体（FAP5-DM1）被应用于多种异种移植的小鼠模型中，实验结果表明该抗体能够有效抑制肿瘤的生长，且无明显的毒性反应[33]。然而在临床试验中，目前尚无靶向FAP 治疗有效的案例。甲磺酸盐（小分子FAP 抑制剂）和西罗珠单抗（FAP 靶向单克隆抗体）都不能证明对结直肠癌患者有效，也因此未通过Ⅱ期临床试验[8]。且有研究[34]表明，以FAP 为靶点消灭CAFs 的同时会损伤骨髓间充质干细胞，从而带来致命性的骨髓毒性。以上研究使得直接靶向CAFs 在临床的应用前景不容乐观。

4.2 间接靶向CAFs

考虑到特异性标志物的缺乏，以及直接靶向CAFs 带来的毒性反应，研究者们开始着眼于抑制CAFs 产生的效应分子。FAP+CAFs 是SDF1 的唯一来源。SDF1 作用于其受体CXCR4 可阻碍CD8+T 细胞浸润，促进免疫抑制微环境的形成；应用CXCR4 抑制剂AMD3100 作用于SDF1/CXCR4 轴可以逆转FAP+CAFs 导致的免疫抑制[23]。SDF1/CXCR4 拮抗剂的安全性正在进一步验证中，有可能成为改善T 细胞浸润的替代疗法[35]。第一代TGF-β 抑制剂具有心血管毒性等严重的不良反应，新一代的TGF-β 激酶抑制剂以及TGF-β 中和抗体的临床试验正在进行中，并表现出良好的耐受性[34]。以TGF-β 和程序性细胞死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）/程序性细胞死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）为靶点的联合治疗具有改善T 细胞浸润、缓解PD-1 抑制T 细胞功能的潜在作用，该治疗策略目前正在多种实体瘤中进行验证[36]。IL-6 单抗联合阻断PD-L1 在鼠黑色素瘤模型中发挥协同作用[37]。MMPs 是CAFs 进行ECM 重塑的重要成员。大量的临床前试验证明，抑制MMPs 具有抗肿瘤的潜能，但鉴于MMPs 家族的复杂性，超过50 种MMPs 抑制剂在Ⅲ期临床试验中均宣告失败[38]。了解MMPs 在不同肿瘤中的作用及机制可能有利于实现MMPs 抑制剂在抗肿瘤治疗中的应用。

5 总结与展望

CAFs 促进肿瘤发生及进展的观点已被广泛接受。尽管研究者们针对CAFs 展开了大量的研究，但到目前为止仍然存在着很多未知领域，尤其是CAFs 的高度异质性为阐明CAFs 调控肿瘤微环境的分子机制带来不小的困难。单细胞测序技术的应用为该领域提供了更多可能。CAFs 与肿瘤细胞及免疫细胞的相互作用较为复杂，其调控肿瘤免疫的关键效应分子值得进一步探索。此外，以CAFs 为靶点的药物试验面临着诸多挑战，寻找其特异性的分子标志物或探究其不同亚型的生物学功能是未来需要解决的关键问题。

参·考·文·献

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