海鲜菇液体菌种生产与质量控制

郑少玲

（福建省仙游县农业农村局，福建 仙游351200）

液体菌种具有制种时间短、接种效率高，定植封面快、发菌周期短，生产成本低、自动化程度高，出菇整齐度高、产品品质好的特点[1]，备受食用菌工厂化生产厂家的推崇。金针菇液体菌种已得到普遍应用，杏鲍菇液体菌种也逐渐替代固体菌种，但海鲜菇液体菌种仅有少数企业在使用，大多处于研究探索阶段[2]。海鲜菇液体菌种应用于工厂化袋式栽培，接种后菌丝12 h 萌发，24 h 封面，菌包发菌培养时间比使用固体菌种约提早10 天，出菇整齐度好，产品品质较优，产量相当。为促进海鲜菇液体菌种生产应用，本文简要介绍其生产流程、各级菌种制作技术要点及质量要求。

1 生产方式与流程

液体菌种生产采用母种（一级种）、摇瓶菌种（二级种）和种子罐菌种（三级种）分级生产方式。各级菌种生产均要按培养基配制、灭菌、冷却、接种、培养至成品的流程进行规范操作，但不同级别菌种的制作技术要求有所差异。

2 母种制备

母种是液体菌种生产的基础，也是液体菌种制作成功与否的关键。母种分为种源母种与生产母种，种源母种应从具备母种（一级种）生产经营许可资质的单位引进，由种源母种扩繁为生产母种，扩繁代数以不超过5 代为宜。

2.1 母种培养基配方与制备方法

母种培养基配方：马铃薯350 g、葡萄糖30 g、琼脂20～25 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g，洁净水1 000 L，pH 6.0～6.5。

根据配方按常规PDA 培养基制作程序进行配制、灭菌、冷却。不同之处在于分装容器需使用克氏瓶。与试管相比，克氏瓶表面较宽，能清晰看出菌丝长势，判断菌种优劣；与培养皿相比，克氏瓶用棉花塞封口，通透性好，可为菌丝生长提供充足氧气。1 000 mL 培养基分装15 个500 mL 克氏瓶，培养基厚度0.5 cm。培养基太薄，易导致培养基干裂影响菌丝生长；太厚，竖放克氏瓶时易引起培养基塌落。

2.2 接种与培养

克氏瓶母种按无菌操作规范接种后，置于22 ℃、空气相对湿度（低于）55%～60%、通风、避光条件下培养。培养至13 天时菌丝生长直径约8 cm，便可用于生产摇瓶菌种。温度是克氏瓶母种培养关键因素，不可过高、过低或忽高忽低。培养过程应定期检查，及时淘汰不合格母种。

2.3 质量检测

克氏瓶母种质量检测包括感官观察、显微检验、杂菌检验与生长速度测定等。通过感官观察克氏瓶有无破损，棉塞是否规范，培养基厚度、均匀度与颜色，以及有无杂菌、螨虫等。如果发现母种容器破损，菌丝生长不整齐，有缺角，发黄、变褐等现象，必须及时淘汰。显微检验先用10 倍物镜观察菌丝粗细，再用40 倍物镜观察形态特征、锁状联合等。若观察到菌丝较细，菌丝直径小于1.8 μm，没有锁状联合的，这类菌丝基本上是单核菌丝，不会出菇，应予以淘汰。杂菌检测主要检测细菌与霉菌，采用回接方法观测，如被感染必须淘汰。生长速度是反映菌种活力的重要指标，记录菌丝生长速度，22 ℃条件下培养13 天，菌丝直径约为8 cm，如出现明显偏差，应追究原因。

3 摇瓶菌种制备

摇瓶菌种相当于固体菌种的原种（二级种），是将母种接种在液体培养基上进行摇瓶培养而成。

3.1 摇瓶菌种培养基制备

摇瓶菌种培养基配方：白砂糖20 g、豆粕粉3.3 g、磷酸二氢钾0.66 g、硫酸镁0.66 g，洁净水1 000 mL，pH 6.0～6.5。

依照配方将配制好的培养基分装至1 000 mL三角瓶中[3]，每瓶装600 mL。分装培养基后的三角瓶瓶口塞上棉塞，棉塞外用铝箔纸或牛皮纸包裹，放入高压锅进行灭菌。灭菌温度121 ℃，压力0.15 MPa，时间40 min，待冷却至18～22 ℃后再接种。

3.2 接种与培养

接种严格遵循无菌操作规范，接种时先去除克氏瓶内老菌块，刮去表面1/2 的气生菌丝，然后切成0.25×0.25×0.5（cm）接种块，每三角瓶接20～30 个接种块，每个克氏瓶母种接2～3 个三角瓶。接种后，将三角瓶放入摇床振荡培养，转速150 r/min，培养温度21～23 ℃，培养时间6～7 天，即得摇瓶菌种。

3.3 质量检测

摇瓶菌种质量检测采用感官观察与取样检测相结合的方法。感官观察包括澄清度、菌丝球状态和气味等，取样检测包括显微观察和pH 测定[3]。感官观察时需将三角瓶静止30 min，优良菌种表现为菌球下沉，上清液澄清透明，表面无或仅有少量泡沫，菌球颗粒大小均匀，菌球表面菌丝呈发散状，有海鲜菇菌丝特有的清香味。取样检测需将菌液涂布载玻片，置于10×40 倍光学显微镜下观察菌丝形态是否粗壮、丰满、均匀，是否具有锁状联合，以此判断菌种优劣。正常pH 为5.6～6.1，如低于5.6，则摇瓶菌种可能被污染。

4 种子罐菌种制备

种子罐菌种相当于固体菌种的栽培种（三级种），是由摇瓶菌种接种在培养罐液体培养基上培养而成。

4.1 种子罐菌种培养基制备

种子罐菌种培养基配方：白砂糖14 kg、豆粕粉2.31 kg、磷酸二氢钾462 g、硫酸镁462 g，水700 L，泡敌60 mL，pH 6.0～6.5。

按配方配制的培养液倒入经消毒的空培养罐内，装料量为培养罐80%，锁好培养罐各管口阀门，并检查是否漏水、漏气[4]。然后置于灭菌锅内灭菌，105 ℃保温20 min，升温至121 ℃保温50 min。待灭菌锅压力降为0 MPa 时方可打开锅门，通水冷却30 min 左右，移至冷却室进行冷却。

4.2 接种与培养

将冷却至19～23 ℃的种子罐移到层流罩下，接通进气管，进气压力保持0.05 MPa，打开层流罩和紫外灯开关30 min，在培养罐的接种口上放置95%的酒精火焰圈套，关闭进气阀门，打开出气阀门，使培养罐压力保持0 MPa。点燃火焰圈，打开种子罐上盖，并提起移至火焰旁边，将经检测合格的摇瓶菌种倒入种子培养罐中，盖上种子罐上盖，打开种子罐进气阀、关闭出气阀，待罐体压力达到0.05 MPa 时，关闭进气阀再移回培养位置培养。培养温度20～22 ℃，培养时，将排气阀全打开，调节进气压力在1.0～1.2 MPa，培养时间6～7 天。

4.3 质量检测

种子罐菌种质量检测除感官观察、取样检测外，还需检测种子罐内CO2浓度变化和菌丝量情况。感官观察时，依次关闭出气阀和进气阀，待菌液不再翻腾时进行静止观察。优良菌种表现菌球下沉，上清液澄清透明，表面无或有少量泡沫，菌球表面菌丝呈发散状；接种后培养1～3 天的种子罐排气的气味为糖豆香味，3～4 天时糖香味转为清香味，随后5～6 天时清香味转浓，7 天时开始转淡，呈现海鲜菇菌种所特有的气味。取样检测需取菌液涂布载玻片，置于10×40 倍光学显微镜下，观察菌丝是否粗壮、丰满、均匀，是否具有锁状联合，以此判断菌种优劣。正常pH 为5.6～6.1，如低于5.6，培养罐菌种可能被污染。CO2浓度检测需用特制容器，在出气口先排尽容器内空气，然后收集种子罐内CO2进行检测。CO2浓度低于1.5%、高于4%属于不正常情况，可能被杂菌污染。采用4 500 r/min离心机分离菌液中菌丝体，以10 mL 菌液中含有1～1.5 g 菌丝量（鲜重）较理想。

5 液体菌种的使用与贮存

海鲜菇摇瓶菌种、种子罐菌种制成后，经检验合格，应立即使用。若遇特殊情况，不能及时使用，需降温保压存放。一般在12～15 ℃以下可保存2～3 天，10 ℃以下可存放3～5 天[5]。