内质网应激在老年性黄斑病变中的作用

高云霞 张元元

河北北方学院药学系，张家口，075000，中国

老年性黄斑病变（senile macular degeneration，SMD）在50 岁以上人群中发病率极高，是导致不可逆性视力丧失的主要原因之一。有研究结果显示，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与多种疾病的发生发展有很大的相关性，希望通过对ERS 在SMD 中作用的探究中可以找到预防获治疗SMD 的新方法。

因为视网膜上皮细胞的吞噬消化能力下降使盘膜残余小体堆积在视网膜黄斑区，由此导致了干性老年性黄斑病变的发生。发生ERS 时，细胞中会有未折叠蛋白或错误折叠蛋白积聚现象的出现，如果ERS 过强或持续时间过长会引起细胞凋亡。由此推测，当视网膜黄斑区受到某种或某些因素刺激后可能引起内质网功能紊乱，进而导致ERS 的发生，ERS 的发生可能会导致SMD。在ERS 发生的早期是机体的一种自身代偿的过程，主要通过增强内质网对蛋白质的折叠和加工的能力进行代偿，同时可以减少内质网中新蛋白的合成，对细胞有一定的保护作用，故对SMD 有预防作用。但如果ERS 过强或持续的时间过久则会使机体走向失代偿，从而激活细胞的凋亡信号通路，然而视网膜上皮细胞的吞噬消化能力下降，这就会导致凋亡细胞因不能及时被处理而堆积于病变区，进而引发或加重病变。因为细胞凋亡、氧化应激、肥胖等可能是引起SMD 的相关因素，所以本文主要从ERS 与它们的关系上来简述对SMD 的作用。

1 老年性黄斑病变的简述

根据老年性黄斑病变在临床观察中的表现和病理学上的改变特点可被分为干性（视网膜萎缩性）和湿性（新生血管性）两型。随着患者年龄的增长，萎缩性老年性黄斑病变患者的基底部视网膜细胞和色素上皮区的细胞的代谢功能会随着衰退，色素上皮细胞外节盘膜的吞噬和消化能力也会下降，这会使视网膜基底部细胞和局部上皮细胞的原浆中积留下未能被完全吞噬消化的盘膜细胞残余的乳白色小体，随着逐年增多并逐渐堆积于患者的视网膜黄斑区，就形成了玻璃膜疣［1］。患者眼部的玻璃膜疣形成较少时可能不明显地影响视力，然而随着时间的延长和年龄增长，使得沉积物堆积逐渐增多，就会导致患者在看一些东西时出现颜色变浅或模糊的现象。晚期时黄斑区的细胞会出现变性、萎缩和死亡现象，导致患者的视野中心有暗点的出现。新生血管性老年性黄斑病变的临床病理特点是眼球壁中膜内的脉络膜血管长入到了视网膜的黄斑区，由于有活跃的新生的脉络膜血管存在于视网膜细胞下或者色素上皮层细胞下［2］，所以倘若新生的脉络膜血管的完整膜结构被损伤或遭到破坏，则会导致新生的脉络膜血管中的物质渗漏甚至出现出血、瘢痕改变或者视网膜下出现积液的现象，这些都会导致患者看东西变形，直线看成波浪线，视野中央有暗点。

2 对内质网和内质网应激的简述

2.1 内质网

内质网膜外与细胞膜的内壁相连，内与核膜的外膜相通，这使得细胞在发挥作用时各细胞器之间能够有条不紊得进行配合，同时也担任着细胞内许多种物质的输入或输出的关键作用。在机体中内质网的作用主要有以下几点：参与机体中糖类和脂类的合成与代谢；固醇类激素的合成，并且也是机体中Ca2+的主要贮存场所；其中粗面内质网上携带有蛋白质的合成场所-核糖体（旧称核蛋白体），所以也是蛋白质产生、加工修饰和运至高尔基体的主要场所。滑面内质网除了对脂类有合成作用外还具有解毒的功能，用以有效清除细胞的脂溶性代谢废物和在代谢过程中产生的各种有害物质。内质网通过内部calnexin/calreticulin 循环的质量调控机制来保证正确折叠了的蛋白质的筛选，并将其通过膜动转运中胞吐的方式运输至高尔基体，如果遇到非正常或不正确折叠的蛋白质时，会将这些蛋白扣留以对其进行完成正确折叠或降解处理的步骤。

2.2 内质网应激

如果机体细胞受到某种打击（如氧化应激、过度肥胖、Ca2+代谢失调、代谢障碍）后，就会使机体内环境稳态遭到破坏，进而导致内质网不能行使正常功能，这种情况下会使粗面内质网中产生突变蛋白或者不可以形成蛋白质二硫键，从而使未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内堆积以及钙平衡失调的发生，这就被称为内质网应激。按照引发ERS 的原因，可以将ERS 引起的下游反应分以下三种类型：①未折叠蛋白反应（unfolded-protein response，UPR），是由于未能够被折叠的蛋白质或者错误折叠的蛋白质在内质网中堆积而引发的；②内质网过度负荷反应（ER over-load response，EOR），是因为正确折叠的蛋白质不能及时被运输而致使其在内质网腔内过度蓄积后激活了细胞核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）而引发的；③因为胆固醇不足而导致的固醇调节元件结合蛋白质（sterol regulatory elementbinding protein，SREBP）通路调节反应［3］。

3 ERS 在SMD 中的作用

因为视网膜上皮细胞的吞噬能力和消化能力均下降致使盘膜残余小体堆积在视网膜黄斑区，由此导致了萎缩性老年性黄斑病变的发生。在发生ERS 时，细胞中会有未折叠蛋白或错误折叠蛋白积聚现象的出现。由此可以推测，当视网膜黄斑区受到某种或者某些因素刺激后可能引起内质网功能紊乱，进而发生ERS。在ERS 发生的早期是一种机体的自身代偿的过程，主要通过增强内质网对蛋白质的折叠和加工的能力进行代偿，同时为了减轻细胞的负担也通过减少内质网中新蛋白的合成来进行调节［4］，对细胞起到一定的保护作用，故而对SMD 有一定的防御作用。但是如果ERS 过强或持续的时间过久则会导致机体的失代偿，从而使细胞的凋亡信号通路被激活［5-6］，然而视网膜上皮细胞的吞噬消化能力下降，这就使得凋亡的细胞不能及时被处理而堆积在病变区，进而引发或加重病变。

3.1 在SMD 中ERS 通过介导细胞凋亡发挥作用

通常人们认为介导细胞凋亡的途径主要有以下几种：线粒体（内源性）细胞凋亡、死亡受体（外源性）细胞凋亡和半胱天冬氨酸蛋白酶12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，caspase-12）细胞凋亡等几种途径［7］。胱天蛋白酶-12 只会在ERS 诱发的细胞凋亡中出现，ERS 也可以对线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径进行调控［8］。

ERS 的作用之一是通过对内质网中稳态的恢复来起到对受刺激或者受打击的细胞的保护作用。但是，如果应激过强或者持续时间过长，会使UPR 的适应性反应不能控制ERS，此时就会使内质网功能紊乱的状态不能够及时恢复。为了有效应对ERS，机体会启动线粒体细胞凋亡途径和非线粒体细胞凋亡途径［4］。此外，如果线粒体和内质网受到强烈地刺激后就很可能会导致细胞中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白比例的失衡，而这两种蛋白比例的失衡会导致细胞凋亡信号被激活［9］，从而致使细胞进入到凋亡途径。另外，在ERS 情况下被激活的蛋白激酶样内质网激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）、1 型内质网转膜蛋白激酶（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）和活化转录因子6（activating transcription factor6,ATF6）［10-11］能够导致凋亡通路下游蛋白CHOP 的过度表达。有研究［12］显示被敲除CHOP 基因的受试动物的细胞内质网中未折叠蛋白或错误折叠蛋白的数目将会明显减少，这就有可能使UPR 达到对ERS 所能控制的范围，从而有可能有效的减轻因ERS 而引起的细胞凋亡。由此可见，因ERS 导致的CHOP 的过度表达可导致细胞凋亡的发生。此外，当细胞处于正常状态时，TRAF2 和Procaspase-12在细胞中可以以稳定的复合物形式存在。而当细胞处于ERS 状态下时，会导致TRAF2 与Procaspase-12 的分离，两者分离会导致caspase-12 被活化［4］。有实验［13］表示如果有caspase-12 缺陷的实验鼠则能够对抗因ERS 而引起的细胞凋亡，然而由其他死亡刺激导致的细胞凋亡仍然可以发生，这就说明了当caspase-12 被活化后是可以引起细胞凋亡的，也说明caspase-12 与ERS 所引起的细胞凋亡途径有着密切的关系［4］，所以可以得出ERS 引起细胞凋亡的另一原因是ERS 的发生会使caspase-12 活化，从而使细胞不可以抵抗因ERS 所引起的凋亡，而导致细胞凋亡。

3.2 在SMD 中ERS 通过氧化应激发挥作用

视网膜色素上皮（retinal pigmentepithelium，RPE）拥有吞噬消化从视杆色素细胞和视锥色素细胞上脱落下来的外节膜盘的能力。色素细胞脱落物被RPE 所吞噬和消化的能力的发挥需要依赖于细胞中有降解和消化作用的溶解体酶系统的降解和吞噬小体系统的消化作用，有些不能被降解消化或消化很慢的脱落物质则会以细小的有荧光性的色素颗粒滞留在细胞内，这种具有荧光特性的细小脱落物被叫做脂褐质。脂褐质的数量会跟随年龄的增长慢慢增多。如果眼睛处于强光条件下，黄斑会被暴露于光照中，作为光敏剂的脂褐质会产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS的刺激会使视网膜细胞受到损伤从而产生应答性反应氧化应激［14］。视网膜细胞的呼吸作用很强，长链多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fattyacids，PUFA）的含量也很高，视网膜的高耗氧量和有作为过氧自由基靶点的PUFA 以及视网膜黄斑暴露于可见光的特性会使视网膜中易有氧化应激反应的发生［15］。氧化应激的发生会致使感光细胞外节受损，促使脂褐质在RPE 中积聚、RPE 进行性肿胀并伴有残留的分子降解，久之会导致RPE 的变性和功能减退［14］。氧化应激也可导致RPE的紧密连接被破坏，渗透性和生存能力发生改变，严重时可导致RPE 发生凋亡，这些因素可能会导致黄斑区RPE、玻璃膜及脉络膜毛细血管的病理性改变和促使脉络膜新生血管的形成［16］。

ERS 过强或者持续时间过长会使细胞氧化应激增加。有研究表明，ERS 可通过对细胞内Ca2+及Ca2+调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响来使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶被激活，从而导致机体中的氧化应激反应增加［17］。未折叠蛋白的堆积会导致内质网中的Ca2+泄露入胞液中，这会使线粒体中产生ROS的量大大增多，从而使机体的抗氧化能力不能够满足大量ROS 的产生所导致的氧化作用，使机体倾向于氧化状态，导致应答性反应氧化应激的发生。然而，如果氧化应激持续时间过长将会使能够对抗氧化作用的元素大量消耗而导致ROS 的产生进一步增加，进而刺激ERS 的发生，继而引起内质网腔中Ca2+泄漏的增加。此外，在维持细胞内氧化还原稳态的平衡中谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSH）两者之间的动态平衡发挥着十分重要的作用［18］。抵抗ROS 的产生以及蛋白质的生成过程均会导致GSH 的消耗，使GSH 变成GSSH。为清除体内过量的ROS，使GSH 大量消耗后会导致GSH/GSSH 的比率严重失衡，这种失衡会导致内质网中蛋白质的错误折叠以及ROS 产生的数量增加［19-20］，最终导致细胞的死亡。在蛋白质的产生过程中会伴随着二硫键的断裂和形成，这种断裂和形成具有周期性。ROS 作为副产物在每个周期中都会产生。由此可见，ERS 与氧化应激互相影响，二者的关系可以作为SMD 治疗的突破口之一。

3.3 ERS 在肥胖造成SMD 中的作用

据美国《眼科学档案》杂志报道，通过减小肚腩的方法可以使人们发生眼科疾病的的概率明显降低，此方法在SMD 的患病率上更为明显。由此可见肥胖也可能是造成SMD 的原因之一。

肥胖与ERS 的联系和脂肪组织中的UPR 激活有关［21］。通过免疫沉淀实验发现，在发生ERS 的内皮细胞表面会看到葡萄糖调节蛋白-78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和内脏脂肪组织中分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂形成可以对内皮细胞凋亡有抑制作用的电压依赖性阴离子通道复合物［22］。肥胖状态下的ERS中GRP78 的表达显著上调，这种上调可以降低内质网腔内未折叠蛋白数量的堆积，靶向降解错误折叠蛋白，从而有助于细胞抵抗过度的应激。如果ERS 过强则导致了GRP78 的表达过度，GRP78 可能会与抑制内质网上促凋亡受体如caspase-7 结合来抑制细胞凋亡［23］。但随着肥胖病情的发展，GRP78 的表达会下降，ERS 逐渐走向失代偿，导致内质网功能不能恢复甚至功能障碍，启动细胞凋亡甚至导致细胞死亡［24］。

Janikiewicz 等指出，过量持续性的摄入脂肪酸会导致其有关的毒性代谢产物的合成，如甘油二酯、甘油三酯和反应性ROS，这些代谢物会使细胞内发生ERS［25］。同时Deldic-que 等［26］的研究表明，长期高脂饮食会影响内质网中的稳态，甚至激活ERS。Deldic-que 等还指出，高脂饮食［26-27］可引起骨骼肌内UPR 的发生，然而，如果为使能量输出增多仅是通过对脂类物质适当增加摄取而不是过量摄入那么就不会引起UPR［28］，由此可见过量摄入脂类而引起肥胖时就可能会导致UPR。由于内质网膜上存在脱饱和酶［29］，所以饱和脂肪酸会以内质网为靶位，这就会导致内质网膜中脂质的分布和形态受到影响，从而会破坏了内质网膜的完整性，内质网内容物逸出（包括钙离子）［30］，使内质网功能不能正常发挥和ROS 的产生量增加进而导致ERS。Mihai 等［31］研究了ERS 和体外脂肪细胞中UPR 的生理触发因素，结果显示脂肪组织重塑时ERS 的标志物之一XBP1的表达会上调［32］，这表明ERS 被激活，继而有UPR的发生。由此可见，肥胖与ERS 和SMD 有着密切的联系。

3.4 ERS 通过减少蛋白质蓄积对SMD 发挥作用

为了应对ERS，机体会通过对UPR 的激活，使内质网在蛋白质的折叠和降解过程中做出相应的调整。在UPR 过程中发挥至关重要作用的热休克蛋白70（heat shock protein，Hsp70）家族的GRP78 可以与发生ERS时产生的未折叠或错误折叠蛋白质结合，促进新产生的蛋白质正确折叠，甚至可以预防因内质网功能紊乱而引起的未折叠蛋白质或错误折叠蛋白质的聚集［33］。有研究［34］显示GRP78 表达的上调会发生在ERS 中，且上调的非常明显。

机体处于正常状态下时，未被激活的Ⅱ型膜转运蛋白ATF6 与同样处于未激活状态的GRP78 相结合［35］。当机体发生ERS 时会有非正确折叠的蛋白质产生，这些蛋白的产生会使ATF6 和GRP78 解离，其中与ATF6分离后的GRP78 会和这些非正确折叠的蛋白质结合，从而大大减少了视网膜病变区内错误蛋白质的产生和堆积。留下的ATF6 则会从内质网膜上通过膜动转运的方式移到高尔基体，紧接着被位于两个位点上的蛋白酶依次剪切，经剪切后形成的N-末端胞质结构域（the cytosolic ATF6 fragment，ATF6f）将会转移至细胞核内，然后促使携带ERS 反应元件（endoplasmic reticulum stress element，ERSE）的基因进行转录［36］，进一步诱导靶基因的表达，然而如果表达过强或持续时间过长使得未折叠蛋白的含量超过UPR 的处理范围后就会上调GRP78 的表达，GRP78 通过与这些非正常蛋白结合使内质网功能恢复正常［37］。此外，内质网相关蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD）基因和转录因子X 盒结合蛋白1（X boxbinding protein 1，XBP1）的转录过程均可以被活化后的ATF6f 触发［38］，然后经翻译产生内质网相关降解蛋白。不管是GRP78 表达的上调还是相关降解蛋白的产生都可以对病变区的堆积蛋白发挥处理作用，减轻病变区细胞的吞噬消化压力。此外，PERK 蛋白对真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）蛋白的N-氨基末端有磷酸化作用，eIF2α被PERK 蛋白磷酸化后可以在蛋白质的翻译过程中对起始复合物内GTP 和GDP 的互换起到阻碍作用，从而使蛋白质的合成量减少，甚至抑制蛋白质的合成，进而减少内质网中新生蛋白质的来源，来起到防止未折叠蛋白或错误折叠蛋白的进一步增加的作用［39-40］，从而降低ERS 发生后内质网中非正常蛋白质的蓄积。ERS 通过减轻SMD 时视网膜色素上皮细胞的吞噬消化压力来起到对SMD 病情的控制作用。

4 小结与展望

在癌症，心血管疾病，神经退行性疾病等多种疾病中都有发现ERS 的信号标志物的表达，故推测ERS 可能成为多类疾病治疗的有效反应靶点。当视网膜黄斑区受到某些因素的长期刺激后，将会导致视网膜黄斑区的稳态被破坏，机体为维持自身的正常功能从而发生ERS。在ERS 发生的早期机体会通过自身代偿机制对损伤的黄斑区进行修复，然而如果打击不能得到有效去除或者ERS 表达强度过强或持续的时间过长，使细胞进入凋亡途径，从而使得病变区细胞吞噬消化压力增大甚至崩溃，最终使病变区损伤加重。Thon 等［41］有发现氧化型维生素C 可以上调ERS 的相关蛋白，氧化应激可能是导致SMD 的原因之一。由此可见，可以通过服用维生素C 等抗氧化剂来防治SMD。辣椒素可以刺激棕色脂肪的形成，棕色脂肪组织可以通过热的形式消散能量，进而减少肥胖的发生。辣椒中含有辣椒素，可以适当的吃些辣椒来减少肥胖的发生。此外，硒蛋白S 在修复ERS 中也起到重要作用。所以在SMD 发生的早期可以通过适度的ERS 对黄斑区损伤细胞进行修复，中后期可以通过对ERS 的调控来减少病变区细胞的损伤达到对SMD 进行治疗的目的。