水果酵素发酵过程细菌变化规律研究

朱会霞，孙金旭，高 越，王 茜，李雪珍

(衡水学院，河北 衡水 053000 )

酵素作为营养食品目前在多个国家及地区都十分流行[1]。酵素是指以水果蔬菜、菌类、动物、藻类等作为原料，经微生物发酵而形成的，含有特定生物活性成分的产品[2]。常见的水果蔬菜、药食同源中药等都可以作为酵素发酵的原料[3]。水果酵素主要是水果作为原料，经过一段时间发酵后得到的可食用的发酵果汁，含丰富的肽类物质、多糖类(小分子)、维生素类物质、多酚类、氨基酸、有机酸、矿物质及可溶性纤维素等生理活性成分。这些成分分一部分来自原料，另一部分来自微生物的代谢过程。

酵素的功效与作用：酵素通过合理的选取原料、合适的发酵工艺，能够制作出多种酵素产品[4-5]。酵素中含有的一些物质，如多酚类物质、维生素A、维生素C和维生素E等，能够清除人体代谢得到的氧自由基，具有抗氧化的功能。已经有实验证实的姜黄素、异黄酮、没食子酸、木酚素、花青素、阿魏酸、咖啡酸等成分可通过抑制致癌物活化而抑制肿瘤[6]。矿物质进入人体后可以保持蛋白质合成、细胞分裂及神经传递的正常进行[7]。酵素中含有人体必需的适量丁酸，通过实验研究发现丁酸可以修复肠黏膜，对治疗肠炎有重要作用，在防治结肠直肠癌和调节基因表达等方面有十分重要的作用。果蔬酵素中的可溶性纤维素纤维膳食虽然不能被消化吸收，但有促进肠道蠕动等功效，对身体健康至关重要[8]。

高通量测序是由Handelsman等提出的，可以覆盖样品中全部微生物，真实地反应微生物的多样性、微生物菌落的构成及其在生态中、代谢产物中所发挥的作用。即用原位裂解法或间接提取法提取出样品的总DNA，或从某些已知DNA序列中挑选出新的基因(簇)[9]。

传统培养基鉴定微生物是对样品进行富集扩培，然后在选择培养基上进行选择性培养。自然界中能够人工培养的微生物很少，样品中多数微生物难以培养，传统鉴定法培养不出全部微生物[10-11]，无法进行检测。高通量测序可以对数以万计的DNA进行测序，对全部微生物种群进行分析，使序列结果分析的速度与准确性都大大提高[12-13]。

当前酵素在我国的发展仍处于初步阶段，人们对于酵素生产及工艺方面的研究很少。对于酵素的生产工艺等各个方面还有待更多、更深入的研究。本研究经由水果酵素发酵液细菌总DNA测序来综合性的判断发酵细菌的种类，旨在经过测序结果分析水果酵素中的细菌种类，继而规范优化操作过程，对水果酵素的生产过程采取有效的防范措施，避免其受到杂菌的污染。在水果酵素的工厂化生产过程中，可以有效的调整生产工艺防止污染杂菌，为提高水果酵素品质提供研究思路和技术方面的支持。

2 材料与方法

2.1 实验材料

水果酵素(正常发酵和染菌发酵)：实验样品源于衡水学院发酵工程实验室。

细菌DNA提取试剂盒(TIANGENDP302-02)、琼脂糖(TIANGEN RT101)、蛋白酶K(TIANGEN RT403)、溶菌酶(TIANGENRT401)、DNA Marker(TIANGEN)。

2.2 试验方法2.2.1 样品镜检

水果酵素发酵过程中所采样品(正常发酵样品和疑似污染的发酵样品)，使用无菌过滤网过滤去除果肉组织后10倍稀释(使用蒸馏水)。取一滴稀释液，滴至显微镜载玻片的中心位置，缓慢的盖上盖玻片(盖玻片与载玻片成45度角)。找到目标视野，高倍镜观察并拍下照片。

2.2.2 样品总DNA的提取

分别取水果酵素正常发酵样品和污染发酵样品的发酵初期、中期和末期三个时期的酵素作为样品，按照DNA提取试剂盒说明书提取总DNA。

总DNA送至深圳华大基因科技服务有限公司进行。取样本微生物DNA中的V4-V5区，对其进行PCR扩增[14]、回收，运用Illumina Miseq高通量测序平台测序[15]，得到物种的FASTA序列。

利用MEGA7软件对物种进行分析，从NABI NR数据库得到标准菌株的系列，进行对比分析，得到这一菌株的进化树，即每种菌所包含的种类，对结果进行可视化展示，挖掘数据中的有效信息。

3 结果与分析

3.1 水果酵素镜检结果

把水果酵素(正常发酵和染菌发酵)发酵中期的样品取出观察。图1a所示为水果酵素在正常发酵中期的镜检结果，能够看到视野中杆状菌占到50%。酵素在正常发酵过程中含有大量醋酸杆菌和乳酸杆菌。从图1b中可以看到，杆菌远远少于球菌。污染的杂菌多为圆形的球菌。

图1 水果酵素镜检结果(发酵中期)

3.2 水果酵素总DNA提取结果

提取的总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，得到图2a三个样品的总DNA的清晰条带。本阶段提取的DNA样品送至深圳华大基因科技服务有限公司进行分析。

图2 水果酵素DNA(1-发酵初期，2-发酵中期，3-发酵末期)

3.3 宏基因组测序结果分析

通过测序结果的分析，得到水果酵素正常发酵和染菌水果酵素发酵中细菌的种类与所占百分比。经过数据分析正常发酵和染菌发酵细菌种类的差异，列出表1中24种主要细菌的对比结果。

表1 正常发酵与染菌水果酵素中的细菌种类对比

表1(续)

水果酵素最终产生的各种代谢成分是由多种细菌在发酵过程的各个阶段共同作用形成的。如表1所示的在发酵中总体数目较多的24种细菌，乳酸杆菌和醋酸杆菌在水果酵素的整个发酵阶段中所占比例相对较大。

通过对数据处理，分析得到水果酵素中百分比的细菌种类有6种，分别是醋酸杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、酸硫杆状菌、明串珠菌、嗜酸菌。下面分别进行分析。

图3 醋酸杆菌进化树

醋酸杆菌是一类短杆菌，均能使糖类和酒精氧化成醋酸等产物。如图3所示，水果酵素发酵过程的醋酸杆菌有酿酒醋酸杆菌(Acetobacter cerevisiae)、奥尔良醋杆菌(Acetobacter orleanensis)、苹果酸醋杆菌(Acetobacter malorum)、河口醋杆菌(Acetobacter estunensis)、硝化醋酸杆菌(Acetobacter nitrogenifigens)、干燥醋酸杆菌(Acetobacter sicerae)、欧洲醋杆菌(Acetobacter europaeus)等多种。

醋酸杆菌在总细菌中的比重随发酵时期的不同而不断变化。如图4所示，在正常发酵过程中醋酸杆菌随发酵的进行不断增加；醋酸杆菌含量从26%升至56%，含量最高。水果酵素发酵初期的醋酸杆菌随着发酵的进行增殖代谢越来越旺盛[16]，可利用糖类生成醋酸等产物。但在染菌酵素中醋酸杆菌的数量随着发酵进行不断减少，从26%降至16%。

图4 醋酸杆菌在水果酵素发酵和染菌酵素发酵过程中数量变化

图5 乳酸杆菌进化树

图6 乳酸杆菌在水果酵素发酵和染菌酵素发酵过程中数量变化

如图5所示，乳酸杆菌包含副酸乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、未分类乳酸杆菌(Lactobacillusunclassified)。在正常发酵中，乳酸杆菌在整个发酵中缓慢增加，从15%增加至19%在发酵末期达到最高。而在染菌发酵过程中，乳酸杆菌的数量初期很低，随着发酵的进行而增加，但也低于正常发酵(图6)。

图7 芽孢杆菌进化树

图8 芽孢杆菌在水果酵素发酵和染菌酵素发酵过程中数量变化

如图7所示芽孢杆菌包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。在正常发酵中，芽孢杆菌随发酵进行百分比降低，从13%降至3%。在染菌发酵过程中，芽孢杆菌随着发酵进行百分比增加(图8)。

图9 明串珠菌进化树

图10 明串珠菌在水果酵素发酵和染菌酵素发酵过程中数量变化

如图9所示，明串珠菌包含肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、酒明串珠菌(Oenococcusoeni)。在水果酵素正常发酵过程中，明串珠菌在所有发酵细菌中所占百分比随发酵进行逐步降低，从18%降至7%。明串珠菌在pH值为3.0～6.5时生长最好，但随着发酵进行pH值逐渐降低至3以下，导致明串珠菌减少。而在染菌发酵中，明串珠菌随着发酵的进行，不断增加(图10)，从3%升至18%。

图11 嗜酸菌进化树

图12 嗜酸菌在水果酵素发酵和染菌酵素发酵过程中数量变化

如图11所示，嗜酸菌主要有嗜酸硫化杆菌(Sulfobacillus acidophilus)系列。水果酵素正常发酵过程嗜酸菌百分比不断增加，从2%增加至6%；而在染菌发酵过程中，嗜酸菌的数量随着发酵的进行而减少，发酵中后期仅有2%(图12)。

4 结论

本实验对水果酵素正常发酵的初中末期的和染菌发酵不同阶段的样品取样，通过镜检、对DNA进行提取、总DNA的PCR扩增及宏基因组测序等步骤测定酵素发酵液中细菌种类及数量变化。确定了正常发酵水果酵素中主要含有的细菌种类，正常发酵过程醋酸杆菌、乳酸杆菌、嗜酸菌均逐渐增加，而芽孢杆菌、明串珠菌是逐渐减少的。而染菌发酵过程醋酸杆菌不断降低，肠膜明串珠菌、乳酸链球菌和酒明串珠菌的迅速增殖抑制了醋酸杆菌。本次研究发现细菌在繁殖过程中相互作用，杂菌的繁殖影响了水果酵素正常代谢，后续研究可以在发酵过程中控制某些细菌的生长，使水果酵素发酵过程控制在稳定的状态。