Dectin-1、CARD9基因在角质形成细胞对红色毛癣菌应答中的作用

陈佳沁?陈剑?邓威威?苏真?梁盼盼?湛舒婷

【摘要】目的 研究树突状细胞相关性C型凝集素-1（Dectin-1）和胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）基因在角质形成细胞对红色毛癣菌应答中的作用。方法 将红色毛癣菌与正常HaCaT细胞、Dectin-1、CARD9基因敲除HaCaT细胞共培养，用ELISA分析其细胞上清液中IL-6、  IL-8的表达情况。结果 Dectin-1基因敲除导致HaCaT细胞IL-6和IL-8基础分泌明显增加，敲除CARD9基因导致HaCaT细胞IL-6基础分泌增加（P < 0.05）。在红色毛癣菌的刺激下，和未感染相比，HaCaT细胞分泌的IL-8明显减少（P < 0.05）;Dectin-1基因敲除的HaCaT细胞则表现为IL-6、IL-8分泌量明显减少（P均< 0.05）;CARD9基因敲除的HaCaT细胞的IL-6、IL-8分泌则无明显变化（P均> 0.05）。结论 Dectin-1基因和CARD9基因可能参与了维持表皮免疫稳态，CARD9基因还可能介导了红色毛癣菌引起的免疫应答。

【关键词】红色毛癣菌;HaCaT细胞;树突状细胞相关性C型凝集素-1;

胱天蛋白酶募集域蛋白9

The roles of Dectin-1 and CARD9 genes in the response of HaCaT cells against Trichophyton rubrum Chen Jiaqin， Chen Jian， Deng Weiwei， Su Zhen， Liang Panpan， Zhan Shuting. Department of Dermatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Chen Jian， E-mail： chj75_0@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the roles of Dectin-1 and caspase recruitment domain-containing protein9 （CARD9） genes in the response of HaCaT cells against Trichophyton rubrum. Methods In this experiment， Trichophyton rubrum was co-cultured with HaCaT cells， Dectin-1-/- HaCaT cells and CARD9-/- HaCaT cells， respectively. The expression levels of IL-6 and IL-8 in the cell supernatant were assessed by ELISA. Results Dectin-1 gene knockout resulted in a significant increase in the secretion of IL-6 and IL-8（both P < 0.05）， CARD9 gene knockout increased the secretion of IL-6 in HaCaT cells（P < 0.05）. After the infection of Trichophyton rubrum， the secretion of IL-8 was significantly decreased in HaCaT cells（P < 0.05）. Dectin-1-/- HaCaT cells showed a significant decrease of IL-6 and IL-8（both P < 0.05）， whereas no evident change was observed in the secretion of IL-6 and IL-8 in CARD9-/- HaCaT cells（both P > 0.05）.Conclusions Dectin-1 and CARD9 genes may play an important role in maintaining the immune homeostasis of the epidermis. CARD9 gene may be involved in mediating the immune response against Trichophyton rubrum.

【Key words】Trichophyton rubrum;HaCaT cell;Dectin-1;

Caspase recruitment domain-containing protein9

皮膚癣菌病是一种全球范围内常见的疾病，红色毛癣菌为主要致病菌[1-3]。通常为浅部真菌感染，仅累及表皮及附属器[4]。在免疫低下患者皮肤癣菌病也可表现为深部真菌感染疾病。致病菌侵入宿主的真皮和皮下组织，进而播散到淋巴结和脑，甚至会危及患者生命[5-6]。

研究者发现树突状细胞相关性C型凝集素-1（Dectin-1）和胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）基因的突变和缺失会损害机体对真菌的抗感染免疫[7-10]。提示这两个基因在皮肤癣菌病致病机制中存在十分重要的作用。HaCaT细胞是人类永生化表皮细胞，与正常人类角质形成细胞分化特性相似。本研究通过分别将红色毛癣菌与正常的HaCaT细胞、敲除了Dectin-1基因的HaCaT细胞、敲除了CARD9基因的HaCaT细胞共培养，检测共培养前后炎症相关因子变化，探讨Dectin-1和CARD9基因在角质形成细胞对红色毛癣菌应答中的作用。

材料与方法

一、实验材料

1. HaCaT细胞

正常HaCaT细胞购买于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，分离自1例62岁患有黑色素瘤男性的正常外周皮肤。Dectin-1和CARD9基因敲除HaCaT（Dectin-1 ko和CARD9 ko）由课题组参照文献[11]通过CRISPR-Cas9技术敲除Dectin-1和CARD9基因构建，并经过蛋白验证和两基因验证保存于液氮中。

2. 皮肤癣菌

红色毛癣菌T1a从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得，并经形态学鉴定以及内部转录间隔区和rRNA大亚基的D1-D2结构域测序确认。

二、主要试剂与仪器

DMEM培养基、TRIZOL试剂购自赛默飞世尔公司;沙保罗氏琼脂培养基购自江门市凯琳贸易有限公司;ELISA试剂盒购于联科生物;酶标仪（EON267603）。

三、方 法

1. 细胞培养

HaCaT细胞用含有10%胎牛血清和1%双抗的高糖改良伊格尔培养基培养至长满细胞瓶，以每孔5×105个细胞接种于六孔板中，培养过夜。

2. 真菌孢子收集

将红色毛癣菌在沙保罗琼脂培养基中传代培养14 d后，加磷酸盐缓冲液用接种环刮取真菌孢子，微旋振荡仪震荡2 min后，11 μm过滤器过滤，2 ml磷酸盐缓冲液洗涤（3000 转/分，15 min） 2次。最后用2 ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（20%蛋白胨、10%酵母提取物、2%葡萄糖）置于37℃恒温水浴锅过夜培养。

3. 细胞与真菌孢子共培养

以感染复数为2将真菌孢子悬浮滴入细胞，置于细胞培养箱（37℃，5% CO2）培养24 h。

4. ELISA检测细胞因子IL-6、IL-8

提取培养24 h后细胞上清液，用ELISA试剂盒（IL-6、IL-8）按照试剂盒说明书进行操作。分别对红色毛癣菌感染前后的HaCaT细胞、CARD9 ko和Dectin1 ko上清液进行测定并用细胞用酶标仪检测。

将3次独立重复实验数据进行统计分析。

四、统计学处理

采用GraphPad Prism 7.04和SPSS 24.0进行数据分析。计量数据以表示。2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnet-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、Dectin-1基因和CARD9基因敲除细胞验证

对基因敲除细胞进行蛋白免疫印迹法验证，以复孔数目为2进行凝胶电泳跑胶，可以清晰地看到Dectin-1 ko、CARD9 ko与HaCaT细胞相比，实验孔目的条带缺失，对照孔（WT）条带明显，见图1。进一步以β-actin为内参抗体，可以发现实验孔与对照孔内参位置的条带都十分清晰。结果表明目的基因已被成功敲除，即基因敲除细胞构建成功，可以用于后续实验。

二、 Dectin-1基因和CARD9基因敲除前后HaCaT细胞上清液中IL-6、IL-8表达情况

敲除了Dectin-1基因的HaCaT细胞IL-6（Dunnet-t = 9.607）和IL-8（Dunnet-t = 3.962）的分泌量均高于正常的HaCaT细胞（P均< 0.05）;而敲除了CARD9基因的HaCaT细胞相比于正常的HaCaT细胞，IL-6分泌量增加（Dunnet-t = 2.924），IL-8分泌量有增加趋势但比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图2（IL-6：F = 34.76，P < 0.001;IL-8：F = 7.344，P = 0.006）。

三、红色毛癣菌感染前后HaCaT细胞上清中IL-6、IL-8表达情况

和未感染红色毛癣菌的HaCaT细胞相比，正常的HaCaT细胞在红色毛癣菌的感染下IL-8分泌量减少（t = 2.921，P < 0.05），IL-6有减少趋势但比较差异无统计学意义（P > 0.05）;Dectin-1敲除的HaCaT细胞在红色毛癣菌的感染下IL-6（t = 9.134）和IL-8（t = 5.611）分泌量均减少（P均< 0.05）;而将红色毛癣菌与CARD9基因敲除的HaCaT细胞共培养后IL-6、 IL-8的分泌量则无明显改变（P均> 0.05），见图3。

讨论

角质形成细胞是表皮最主要的构成细胞，其表面的模式识别受体可以识别微生物的病原相关分子模式，诱导产生相应的固有免疫信号，对抵御微生物皮肤感染有重要的作用[12-14]。然而皮肤表面有大量的正常菌群寄生，因此相关的固有免疫必须维持一个合适的强度，以维持表皮的免疫稳态。我们的研究表明敲除Dectin-1和CARD9影响到了角质形成细胞IL-6和IL-8的基础分泌，这表明Dectin-1、CARD9信号通路对于参与维持表皮的免疫稳态有重要的作用。

红色毛癣菌是最主要的亲人性皮肤癣菌，和亲动物性、亲土性皮肤癣菌相比，红色毛癣菌感染所导致的皮损炎症轻微，感染更倾向于慢性[15]。我们的实验显示角质形成细胞被感染后，前炎症因子IL-6和中性粒细胞趋化因子IL-8的分泌都有降低趋势。这表明角质形成细胞识别红色毛癣菌后产生的一些信号，可以抑制IL-6和IL-8的分泌。这可能是其感染炎症反应轻微的重要机制。进一步研究发现，敲除Dectin-1并没有改变这一趋势，和没有感染的阴性对照相比，Dectin-1敲除的HaCaT细胞，在红色毛癣菌感染下IL-6、IL-8仍是降低趋势。这表明角质形成细胞并非通过Dectin-1来感受红色毛癣菌的感染，进而下调IL-6和IL-8的表达。而敲除CARD9后，红色毛癬菌感染不能诱导角质形成细胞下调IL-6、IL-8。因此我们推测角质形成细胞通过某一受体，识别红色毛癣菌，产生的信号经由CARD9介导，最终抑制IL-6和IL-8 的表达。

Dectin-1受体是一个胞外 C 型凝集素样跨膜受体，可识别真菌细胞壁碳水化合物中的β-（1，3） -葡聚糖[16]。在髓样细胞中，Dectin-1一般通过识别配体触发细胞中多种信号导致细胞内脾络氨酸激酶（Syk）富集，作用于CBM复合体诱导激活NF-κB信号通路[17-18]。CARD9属于CARD家族中的一员，是Dectin-1以及Dectin-2、Dectin-3等其它C型凝集素样受体下游通路中的一个重要衔接蛋白，在抗真菌免疫中发挥重要作用[19-21]。我们的研究提示CARD9介导了红色毛癣菌感染诱导的IL-6、IL-8下调，而Dectin-1并未参与这一过程。CARD9可能是接受了其它可以识别红色毛癣菌的受体产生的信号，如Dectin-2、mincle等并進一步向下游传导[22-23]。

我们通过红色毛癣菌和永生化的角质形成细胞共培养开展体外研究，尚不能完全明确Dectin-1和CARD9基因对红色毛癣菌感染临床表现和转归的影响。仍需要进行动物感染模型研究，或对先天性Dectin-1和CARD9缺陷并伴有红色毛癣菌感染的患者开展临床研究以明确其作用。

综上所述，Dectin-1基因和CARD9基因可能参与了维持表皮免疫稳态，CARD9基因还可能介导了红色毛癣菌引起的免疫应答。

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（收稿日期：2020-06-12）

（本文編辑：杨江瑜）