甜瓜抗白粉病及蔓枯病种质资源的分子标记筛选

张爽爽 陈莹 滕巍 张金鹏 李阿红 惠长敏

摘    要： 为了快速而准确地筛选携带抗病基因的甜瓜种质资源，利用分子标记辅助选择技术对81份甜瓜种质资源是否携带抗白粉病基因、抗蔓枯病基因进行分析。结果表明，81份甜瓜種质资源中筛选出携带抗白粉病基因的甜瓜材料19份，其中携带纯合抗性基因的甜瓜材料4份;筛选出携带抗蔓枯病基因的甜瓜材料5份;同时携带抗白粉病基因和抗蔓枯病基因的甜瓜材料1份。本试验研究结果可为甜瓜抗病资源的分子标记筛选及甜瓜抗病育种提供参考。

关键词：甜瓜;种质资源;抗病基因;分子标记;白粉病;蔓枯病

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2020）11-008-05

Abstract： In order to screen the disease resistant melon germplasm resources quickly and accurately， molecular marker assisted selection was used to analyze 81 melon germplasm resources for powdery mildew and gummy stem blight resistance genes. The results showed that among the 81 melon germplasm resources， 19 melon materials with powdery mildew resistance genes were selected， among which 4 were homozygous resistance genes. 5 melon materials carrying gummy stem blight resistance genes were selected. One melon material carrying resistance genes to powdery mildew gene and gummy stem blight. This result provides reference for molecular marker screening and melon breeding for disease resistance.

Key words：Melon; Germplasms; Resistance gene; Molecular markers; Powdery mildew; Gummy stem blight

白粉病是危害甜瓜生产的一种主要病害，在甜瓜整个生育期内均可发生。导致甜瓜白粉病的病原菌有3个属6个种，其中主要病原菌是单囊壳白粉菌和二孢白粉菌，我国甜瓜白粉病均由单囊壳白粉菌引起[1-2]。由于甜瓜白粉病生理小种多、分化快，给白粉病的防治带来困难，因此利用甜瓜自身携带的抗病基因防治白粉病是最直接有效的手段。根据“甜瓜基因目录”中记载，目前已发现的甜瓜抗白粉病基因共20个，由不同种质资源载体携带[3]。近年来，随着甜瓜基因组测序的完成及测序技术的不断发展，与白粉病抗性基因连锁的分子标记已有报道，可为分子标记辅助选择甜瓜抗病育种提供便利[4]。

抗白粉病甜瓜种质资源‘MR-1是国际鉴定甜瓜白粉病生理小种的鉴别寄主之一，该材料对单囊壳白粉菌的Race1、Race2、Race3、Race5及二孢白粉菌的Race0、Race1均表现出抗性，但是其携带的抗性基因尚不明确。李冰等[5]以抗白粉病甜瓜自交系‘MR-1及感白粉病自交系‘Top Mark为材料，对‘MR-1携带的抗白粉病基因进行研究，获得与‘MR-1中抗白粉病基因紧密连锁的分子标记BSA12-LI4HINFI。以分子标记BSA12-LI4HINFI为引物进行PCR反应，在甜瓜基因组中均可扩增出525 bp的DNA片段，将PCR产物回收后用Hinf I限制性内切酶进行酶切，抗病单株被酶切成351 bp和174 bp，而感病单株仍然为525 bp。虽然与BSA12-LI4HINFI标记紧密连锁的抗性基因尚未报道，但是分子标记BSA12-LI4HINFI可以有效筛选甜瓜中是否携带同‘MR-1相同的抗白粉病基因。

蔓枯病是甜瓜生长中后期容易发生的一种土传性病害，该病害危害甜瓜叶片、果实和茎蔓[6]。蔓枯病由亚隔孢壳属的瓜类黑腐球壳菌所引起，目前尚未确定致病菌生理小种的分化[7]。目前已发现5个抗蔓枯病的独立基因，分别是Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5，由不同抗病种质资源所携带[8-9]。虽然还没有抗蔓枯病基因被成功定位和克隆，但是随着甜瓜基因组研究水平的不断深入，与甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3相关的分子标记不断被报道[10-12]。

抗蔓枯病甜瓜种质资源‘PI482398携带抗蔓枯病基因Gsb-4，研究表明，该种质在我国长江中下游地区表现出对蔓枯病的抗性高于携带Gsb-1基因的‘PI140471[13]。华德平等[14]以抗蔓枯病的‘PI482398和感蔓枯病的‘白皮脆为材料，开发出与Gsb-4基因连锁的能够鉴定甜瓜蔓枯病抗性的SSR分子标记专用引物。以鉴定甜瓜蔓枯病抗性专用引物进行PCR反应，通过电泳对扩增产物进行检测，扩增结果为135 bp DNA片段的单株为抗蔓枯病材料，扩增结果为105 bp DNA片段的单株为感蔓枯病材料。利用该专用引物，可以快速鉴定出甜瓜对蔓枯病的抗性。

笔者采用李冰等[5]发表的鉴定白粉病抗性的分子标记BSA12-LI4HINFI和华德平等[14]开发的鉴定甜瓜蔓枯病抗性专用引物，分析81份甜瓜种质资源是否携带抗白粉病基因及蔓枯病基因（Gsb-4），筛选出携带抗白粉病或抗蔓枯病基因的甜瓜种质资源，以期为甜瓜抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的81份甜瓜种质资源由吉林省蔬菜花卉科学研究院西甜瓜研究中心提供，其中包括杂交种、野生种、地方品种及高世代材料。2019年3月20日将81份甜瓜材料播种在吉林省蔬菜花卉科学研究院西甜瓜中心育苗温室，4月20日定植于甜瓜大棚，在整个生育期内对81份材料田间白粉病及蔓枯病的自然发病情况进行调查。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜基因组DNA的提取 待甜瓜苗生长至3叶1心时，取幼嫩叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取甜瓜基因组DNA，并对提取的甜瓜基因组DNA浓度及质量进行检测。

1.2.2 PCR反应体系及扩增条件 PCR反应体系：2×mix Buffer（含DNA聚合酶、dNTP等）12.5 μL，上游引物+下游引物2 μL，DNA模板2 μL，补充ddH 2O至25 μL。引物序列详见表1。

PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 PCR产物检测 利用2%琼脂糖凝胶电泳（150 V，35 min）对PCR产物检测。

1.2.4 PCR产物回收 BSA12-LI4HINFI是CAPS标记，需要继续进行酶切反应，电泳后回收胶块，利用胶回收试剂盒进行PCR产物回收纯化。

1.2.5 酶切体系及反应条件

酶切体系：10×Buffer 2 μL，HinfI 1 μL，底物10 μL 补充ddH2O至20 μL。酶切条件：37 ℃酶切30 min，82 ℃变性20 min。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取与检测

利用植物基因组DNA提取试剂盒提取81份甜瓜基因组DNA，并利用核酸浓度检测仪对获得的DNA浓度及质量进行检测，提取的DNA浓度在12.3～46.4 ng·μL-1之间，OD260/280数值在1.83～2.00之间，符合后续PCR试验要求。

2.2 抗白粉病材料鉴定结果

以分子标记BSA12-LI4HINFI为引物，在81份甜瓜基因组DNA中均可扩增出525 bp的条带，将PCR产物回收后用HinfI限制性内切酶进行酶切，有19份甜瓜材料条带被切成351 bp和174 bp，说明这些材料携带抗白粉病基因。但是在这些材料中有15份材料同时含有525 bp、351 bp和174 bp条带，只有4份材料完全酶切成351 bp和174 bp。结合被筛选甜瓜资源类型分析，15份材料中包括杂交种5份、地方品种4份、高世代材料6份，说明这15份材料携带的可能是杂合抗病基因，而4份完全酶切的材料携带的是纯合抗病基因。酶切电泳图如图1所示，材料抗性信息见表2。

2.3 抗蔓枯病材料鉴定结果

如图2所示，以鉴定甜瓜蔓枯病抗性专用引物进行PCR，有6份材料扩增出135 bp的DNA片段，说明这6份材料含有Gsb-4抗蔓枯病基因。其余全部为105 bp的DNA片段，说明这些材料都不含有Gsb-4抗蔓枯病基因。材料抗性信息见表2。

2.4 田间自然发病情况调查结果

在对81份甜瓜资源的抗病性进行分子标记筛选的同时，将材料在田间自然表现进行观察记录。19份携带抗白粉病基因的材料，在田间均表现出高抗或中抗白粉病;6份携带抗蔓枯病基因的甜瓜在田间并未发现感染蔓枯病。分子标记鉴定结果和田间发病情况调查的结果是一致的。

3 讨论与结论

通过采用李冰等[5]发表的鉴定白粉病抗性的分子标记BSA12-LI4HINFI，对81份甜瓜种质资源是否携带抗白粉病基因进行分析，结果发现，19份材料被酶切成351 bp和174 bp片段，但是其中15份材料在酶切后同时存在525 bp、351 bp和174 bp的片段，CAPS標记可以有效区分纯合杂合基因型[15]，说明这15份材料携带的可能是杂合抗病基因，而4份完全酶切的材料携带的可能是纯合抗病基因。

采用华德平等[14]开发的鉴定甜瓜蔓枯病抗性专用引物，对81份甜瓜种质资源是否携带抗蔓枯病基因进行分析，结果发现，只有6份材料含有抗蔓枯病基因，抗性材料仅占8%。可能是因为本研究所筛选的材料多为薄皮甜瓜，薄皮甜瓜资源自身携带的抗蔓枯病基因与‘PI482398有所差异或是自身确实不含蔓枯病抗性基因，导致筛选出的抗性材料较少。

本试验中分子标记鉴定结果和田间自然发病情况调查结果是一致的，说明笔者所采用的2个标记准确性较高。在筛选的材料中，19号甜瓜材料同时携带抗白粉病基因和抗蔓枯病基因，该材料为甜瓜野生资源，野生资源的抗病性相对较强，这也验证了本试验所采用的2个分子标记准确性较高，说明分子标记筛选的结果是可靠的。

笔者利用分子标记辅助选择技术对81份甜瓜种质资源是否携带抗病基因进行研究，筛选到携带抗白粉病基因的甜瓜材料19份，其中携带纯合抗性基因的甜瓜材料4份;筛选到携带抗蔓枯病基因的甜瓜材料5份;同时携带抗白粉病基因和抗蔓枯病基因的甜瓜材料1份。目前已知甜瓜抗白粉病基因有20个、抗蔓枯病基因有5个，这些基因被不同的甜瓜种质资源所携带[3，8]。笔者采用的2个标记仅限筛选与‘MR-1及‘PI482398（Gsb-4）相同的抗病基因，因而这些被筛选材料中也可能携带其他抗病基因，需要与之对应的分子标记去筛选。为了能够完整评价材料的抗病性，需要开发更多与抗病基因紧密连锁的分子标记，或是采用多个抗病基因分子标记去筛选含有综合抗性的甜瓜资源。在后续研究中，笔者将继续筛选具有多个抗病基因的甜瓜资源，为培育具有综合抗性的甜瓜品种提供育种材料。

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