单原子催化剂的生物医学应用

袁中文，贺利贞，陈填烽

（暨南大学化学系,广州510632）

单原子催化剂（SACs）是指孤立金属原子稳定在合适载体上的催化剂，目前已发展成为催化科学领域中最具创新性和发展最快的研究方向之一［1］.SACs中单原子与载体界面结合产生的强金属-支撑相互作用能够有效阻止单原子迁移和聚集，并促进低配位环境和电荷转移效应，同时充分暴露的活性原子中心使其具有更高的催化活性［2］.2011年，Zhang等［3］首次报道了SACs，实现了单原子Pt稳定分散在FeOx载体上用于CO的催化氧化.2017年，Fako等［4］探究了不同载体（氧化物、金属或氮化碳）对SACs的影响，发现SACs稳定性和活性的特殊性质在很大程度上取决于所选择的基质.在含氮碳材料上锚定单金属原子可以得到含有M-Nx-C位点的SACs，其与天然金属酶的M-Nx位点相似.如，氧肌红蛋白、辣根过氧化物酶（HRP）和细胞色素P450酶的活性位点在近端配体处含有血红素b辅因子，类似于铁基SACs中的FeN4和FeN5位点［5～7］.事实上，SACs具有许多和酶催化剂相似的特征，特别是在几何和化学结构以及原子水平上的电子结构方面，并且与天然酶和纳米酶相比，SACs具有合成策略更简单、活性中心和形貌可控、配位环境可调、催化活性更优异、成本低、更容易实现商用以及有利于对催化反应机理的研究等优势［8］.SACs也代表着最大限度的金属原子利用率和金属催化剂最大使用效率，其优异的催化活性和选择性使其成为近年来生物医学领域研究最多的催化剂之一［9］.

近十几年来，纳米酶研究发展迅速，2007年Yan等［10］意外发现了具有类过氧化物酶活性的Fe3O4纳米粒子；2013年，Wei等［11］赋予了“纳米酶”清晰的定义——具有类似酶活性的纳米材料.纳米技术和生物医学技术的发展使纳米酶在疾病治疗及诊断领域备受关注［12，13］.从纳米颗粒到量子点、原子簇，随着纳米尺寸的进一步减小，材料表现出的性能也愈发活泼，特别是SACs将尺度范围缩小到了单个原子水平，催化反应可在每一个原子上进行，因此其类酶活性将得到进一步提高，这使得SACs成为连接纳米技术和生物医学的高效催化剂的候选者［14］.然而，随着金属粒子尺寸发展到单原子水平，金属的表面自由能也急剧升高，原子很容易发生聚集形成团簇或粒子，因此解决单原子的稳定性，以制备原子分散的SACs成为了其发展的关键挑战之一［15］.

纳米技术的飞速发展为SACs的制备提供了强力支持，各种各样的SACs被设计合成出来，不同的支撑材料或不同的负载金属原子赋予了SACs多变的材料性能，其中以碳基材料［16］、二维材料［17，18］或金属氧化物［19，20］作为载体，荷载贵金属［21，22］或铁、钴、镍［23～25］单原子的研究尤为广泛，个别研究报道使用了金属有机框架（MOF）作为载体［26，27］.先进的表征技术也促进了SACs的迅猛发展，使它们在催化领域展现出广泛的应用前景［28，29］.目前，SACs在生物医学领域的应用正处在起步阶段，研究较广泛的载体主要为氮掺杂碳材料，金属原子对象主要为铁原子.表1汇总了近年来SACs在肿瘤治疗、抗菌、抗氧化及生物传感领域的应用实例［5～8，30～43］.以已应用在催化领域的SACs设计策略指导未来合成具有生物催化效应的多功能材料是一项重要工作，将推动纳米材料的进一步发展和应用.

Table 1 Examples of application of SACs in biomedical field in recent years

1 单原子催化剂的生物医学应用

SACs具有100%的金属原子利用率以及高催化活性和选择性，在催化领域展现出了广阔的应用前景［17］，通过排列氮原子与金属原子将高活性均匀分散的M-Nx位点锚定在碳基材料上作为仿天然金属酶的单原子纳米酶，或者将自身具有类酶活性的单分散金属原子固定在适合载体上增强催化活性，在催化生物医学领域展现出了巨大的潜在应用价值.本文综述了近年来SACs在生物医学领域的应用，包括肿瘤治疗、抗菌、抗氧化和生物传感（图1）；并对其未来的挑战和机遇做了简要概述，以期为开发新一代具有类酶活性的SACs提供合理策略.

1.1 单原子催化剂在肿瘤治疗中的应用

Fig.1 Illustration of SACs biomedical applications

恶性肿瘤具有高发病率和致死率，已成为威胁人类健康和导致人类死亡的重要原因之一［44，45］.目前，传统的化疗、放疗和手术切除三大手段在肿瘤治疗中仍扮演着重要的角色，靶向治疗［45］和免疫治疗［46，47］受到广泛关注并在临床上有重大进展；同时，基于有机或无机纳米材料［48，49］的光动力学治疗（PDT）、光热治疗（PTT）等纳米催化治疗方法也逐渐得到应用［50～52］.然而，肿瘤部位复杂的环境通常会导致治疗失败，如，乏氧是实体肿瘤一个重要特征，也是造成放疗抵抗及不良预后的一个重要因素［53］.为克服固体肿瘤的长期乏氧环境、增强PDT治疗效果，Zhao等［30］开发了生物相容性良好、能持续催化O2生成的单原子Ru纳米PDT平台OxgeMCC-r SAEs［图2（A）］.其以普鲁士蓝类似物Mn3［Co（CN）6］2作为MOF，在Ru3+部分取代框架上的Co位点后经过NaBH4还原节点得到了单原子Ru作为催化中心进行原位产氧；另外在MOF自组装时将具有光敏能力的二氢卟吩e6（Ce6）进行包封，以PVP形成外保护层，最终得到单原子酶OxgeMCC-r SAEs［图2（B）］.持续产氧能力测试表明，OxgeMCC-r SAEs体系在20 min内能消耗约50%的H2O2［图2（C）和（D）］，并且在多次添加H2O2后催化活性保持不变［图2（E）］，证明该体系具有高且稳定的催化性能.随后，对荷载了小鼠乳腺癌的小鼠进行体内PDT实验，经激光照射的OxgeMCC-r SAEs组比其它组显示出明显的肿瘤抑制作用［图2（F）］.免疫荧光染色分析证实了OxgeMCC-r SAE对肿瘤内缺氧状态的原位改善作用［图2（G）］，这对PDT治疗效果做了很好的解析.由于Mn与6个氮原子配位形成高自旋的Mn-N6，使得该体系具有磁共振成像（MRI）能力，肿瘤部位的MRI测试结果表明，在OxgeMCC-r SAE体系静脉给药6 h后MRI信号强度达到最大值，且在48 h后仍然保留有较强的信号［图2（H）］，显示了长时间核磁成像指导下的体内治疗.这项工作为掺入单原子，联合成像治疗一体化平台提供了合理可行的设计策略.

Fig.2 Self-assembled monoatomic nanozyme OxgeMCC-r SAE enhancing tumor PDT[30]

Fig.3 Tumor therapy of monoatomic iron nano catalysts PSAF NCs[31]and porphyrin-like monoatomic iron nano systems P-MOF[32]

在肿瘤微环境（TME）中原位催化产生有毒的活性氧（ROS）物种以实现肿瘤治疗具有很大的吸引力［54］.为实现高催化活性，提高肿瘤相关纳米催化治疗的效果，Shi等［31］开发了单原子铁纳米催化剂（PSAF NCs）.PSAF NCs由Fe（acac）3@ZIF-8在氩气流保护下经过800℃热裂解3 h得到，其能够有效响应弱酸性的TME选择性地原位触发肿瘤部位芬顿（Fenton）反应产生大量有毒的羟基自由基（·OH），进而引起肿瘤细胞的凋亡、脂质过氧化物积累和肿瘤细胞铁下垂［图3（A）］.此外，基于PSAF NCs的碳载体的光热转化特性，温和的光热使Fenton催化效果更显著，可以达到完全消除肿瘤的目的.基于密度泛函理论（DFT）计算，揭示了PSAF NCs的催化机制［图3（B）］.简言之，在酸性肿瘤环境下，质子介导OH*形成H2O分子并随后从催化剂的活性中心释放，从而使其复活以不断产生·OH；而中性环境下留在活性位点的OH*物种难以克服能量障碍而解吸，纳米催化剂失活导致催化活性显著下降，这也预示了PSAF-NCs将具有很好的肿瘤特异性响应和生物安全性.在细胞水平上，对小鼠乳腺癌细胞（4T1）增殖抑制作用进行了系统研究，结果表明，在酸性培养基下100μmol/L H2O2联合200μg/mL PSAF NCs处理组观察到显著的增殖抑制效果，而中性培养基对细胞毒性作用则较弱［图3（C）］，这与DFT计算结果一致.细胞凋亡潜在机制研究表明，PSAF NCs可能通过铁下垂和凋亡途径引起细胞死亡［图3（D）］.在体内实验中，与生理盐水组对比，PSAF NCs处理组表现出良好的肿瘤抑制效果［图3（E）］.在结合光热治疗后，瘤内给药和静脉给药组分别在第5天和第9天完全根除肿瘤［图3（F）］，说明光热有效增强了Fenton催化治疗效果.此项工作为实现肿瘤纳米催化治疗设计肿瘤原位Fenton催化体系提供了有效策略.另一项工作中，Zhou等［32］报道了一种类卟啉单原子Fe（Ⅲ）中心的金属有机骨架（P-MOF），在近红外光（808 nm）辐射下，通过PDT/PTT联合治疗评估了P-MOF在癌症治疗中的性能，同时探究了P-MOF光声成像PAI性能［图3（G）和（H）］.这项工作预示了SACs在肿瘤治疗和肿瘤成像方面的巨大潜力.

线粒体氧化还原稳态在许多生物过程中起着关键作用［55］，已发展成为癌症治疗的一个潜在靶点［56］.一个有效治疗肿瘤的策略是，通过提高ROS和降低谷胱甘肽（GSH）水平放大线粒体内ROS的水平进而诱导癌细胞凋亡［57］.Au能与GSH形成Au—S键而消耗GSH，而具有原子活性分散位点的SACs能显著提高Au原子的利用效率，增强Au原子和GSH之间的生化反应选择性.Liang等［33］报道了一种单原子分散金纳米体系（MitoCAT-g），该体系以碳点为支撑材料负载单原子金，再经肉桂醛（CA）以及三苯基膦（TPP）修饰得到［图4（A）］，其实现了15.3%（质量分数）单分散Au原子的高负载.在细胞水平上研究了MitoCAT-g消耗GSH的能力［图4（C）］，发现经浓度为64μg/mL的MitoCAT-g处理后线粒体GSH水平下降至12%，而当不经CA修饰的体系（TPP-CAT-g）与GSH预孵育以占据Au原子时线粒体GSH水平几乎无变化［图4（D）］，这表明MitoCAT-g高度分散的Au原子对于GSH消耗具有重要意义.MitoCAT-g经内吞进入细胞后，CA在酸性环境下释放并随后产生ROS，TPP-CAT-g颗粒通过线粒体与GSH形成Au—S键进而消耗GSH，因此MitoCAT-g能够放大线粒体中的氧化应激水平并引起细胞凋亡［图4（B）］，蛋白质印迹法检测促凋亡蛋白的切割和染色体DNA的断裂也证实这一观点［图4（E）和（F）］.体内实验中使用雌性NOD-SCID小鼠荷载病人来源的肝细胞癌原位移植模型（HCC PDX）［图4（I）］，生理盐水组所有小鼠在第43天死亡，而MitoCAT-g治疗组在第79天和第94天的存活率则分别为87.5%和75%［图4（G）和（H）］.另外，对比于其它组，MitoCAT-g处理组Bcl-2和Ki67蛋白的表达减少，而caspase-3和TUNEL（脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记物）的表达则增加［图4（J）］，证明了MitoCAT-g处理的PDX肿瘤细胞凋亡增强，表现出显著的抗肿瘤活性.这项工作证明MitoCAT-g是一种很有前途的安全的抗癌药物，为开发小尺度支撑材料的单原子催化剂以及设计单分散金属用于高效生化反应提供了可行策略.

值得一提的是，硒作为人体必要的微量元素之一，具有抗肿瘤、抗氧化及提高免疫力等多种活性，在防治疾病中发挥着重要作用［58］.过去十年，我们一直致力于元素态硒的设计合成及生物医药应用方面的研究［59～65］.基于硒的化学价态变化特性，合成了零价态的元素纳米硒，构建了“治疗性纳米硒药物”.通过表面化学修饰提高纳米硒粒子的分散性质与再加工性能，引入高分叉多糖及多糖-蛋白复合物制备了高稳定性的纳米硒，通过化学手段对其进行形貌调控及功能化修饰，以提高纳米硒的生物利用度、生物相容性及抗肿瘤活性.在此基础上，基于纳米硒的表面化学特性，进行多重靶向性功能化修饰，并将其作为“治疗性载体”负载具有协同作用的小分子抗肿瘤药物，实现了协同治疗的效果.同时，深入阐明纳米硒药物的抗肿瘤活性与作用机制，发现该纳米体系可通过调控P53，TrxR，AKT及MAPKs信号通路来发挥抗肿瘤活性.在此基础上，针对肿瘤细胞膜高表达多种蛋白质与受体（整合素、叶酸受体及生物素受体等）的特点，将肿瘤靶向性识别多肽共价结合到纳米体系表面，构建靶向纳米药物，显著提高了其对肿瘤细胞和正常细胞之间的选择性，增强抗肿瘤活性，降低毒副作用，同时能有效逆转肿瘤多药耐药，真正实现高效低毒及对肿瘤的精准治疗.

Fig.4 Oxidative stress for tumor therapy magnified by carbon dot-supported single-atom dispersed gold system MitoCAT-g[33]

尽管如此，这种由硒原子堆彻而成的硒纳米粒子的活性表现欠佳，且其活性随着纳米粒子尺寸的减少而增加［66］.单原子催化剂100%的原子利用效率引起了我们的重点关注，并推测单原子硒纳米体系的设计将会最大程度地解决硒活性欠佳的问题，这也是基于2019年Wang等［5］工作的合理推测.他们将硒原子分散在多孔碳膜上用作肼燃料电池的电极，表现出比最先进的商用Pt/C催化剂更优越的催化活性以及在肼氧化反应中的高稳定性.他们将2种聚离子液体混合在DMF中，然后经滴涂、干燥及NH3浸泡以形成多孔聚离子液体膜，最后在真空条件下热解得到终体系SeNCM［图5（A）］.由STEM图像可以看到单原子硒的存在（红色圈里的白色亮点）［图5（C）］.特别的是，这种硒单原子很容易被以共价键形式存在的大量C原子稳定下来，而不是N掺杂碳原子中的少量N原子，与前述的M-Nx位点大有不同，这与半金属原子的结构优点有关［图5（B）］.重要的是硒原子作为SeNCM的催化中心在肼氧化性能指标评估中可与Pt/C相媲美［图5（D）］，其开路电位、最大电流密度和功率密度与Pt/C相近甚至更优，表明单原子硒的催化活性足够高.这项工作将有助于开发单半金属原子的SACs，扩大SACs的适用范围，为更广阔的生物医学应用提供强大的动力.

Fig.5 Synthesis and application of single atom selenium anchoring on porous carbon membrane[7]

1.2 单原子催化剂的抗菌应用

病原菌引起的细菌感染是威胁人类健康的棘手问题.最近，Liu等［5］将PMCS单原子纳米酶体系用于抗菌促伤口愈合［图6（A）］，该体系以ZIF-8为前驱体，采用二氧化硅保护法在氮气氛围下经过800℃热裂解2 h，随后用聚乙二醇-维E修饰制得.通过高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADFSTEM）、电子能量损失谱（EELS）及扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）等表征手段证实了单原子Zn的存在［图6（B）～（D）］.通过测定酶对底物H2O2的米氏常数（KM）评估了PMCS纳米体系的催化性能，结果证明PMCS与HRP催化能力相当.通过电子自旋共振（ESR）检测验证了·OH产生情况［图6（F）］.另外，利用密度泛函理论（DFT）计算探究了不饱和活性Zn位点与H2O2作用的可能催化机制［图6（E）］，即首先H2O2分子被吸附在PMCS的活性部位并迅速被激活，随后的溶血途径使H2O2分解形成2个OH*，1个OH*从活性部位逸出形成·OH，另1个OH*保留，该过程的总自由能为0.24 eV［图6（G）］，在室温下容易克服从而发生反应.体外实验结果表明，在H2O2参与下，PMCS在体外对铜绿假单胞菌的生长的抑制率为99.87%［图6（H）］.在体内治疗铜绿假单胞菌感染的小鼠创面，经PMCS处理的小鼠在第6天伤口完全愈合［图6（I）］，组织学染色结果也证实了伤口愈合程度［图6（J）］.这项工作预示了SACs作为抗菌伤口愈合剂的潜在应用.

抗生素的滥用造成了细菌多药耐药（MDR）的问题［67］，而能产生ROS的相关材料对于增强杀菌活性克服耐药具有显著效果，但其催化活性受到材料本身限制［68，69］.利用SACs的高活性和高选择性等特性，Shi等［34］开发了一种以无定形碳为载体负载铁单原子的纳米催化剂（SAF-NCs）.基于“包裹高温热解”策略，Fe单原子进入并取代ZIF-8的Zn位点形成的Fe-N4位点，这类似血红素的单铁原子活性位点，能够有效产生·OH，联合碳材料本身的近红外光热效果能够起到良好的杀菌作用［图7（A）］.在体内实验中，利用碳材料在808 nm激光下产生轻度光热效果［图7（B）］，SAF-NCs联合NIR对大肠杆菌（革兰氏阴性菌E.coli）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌S.aureus）小鼠体内感染模型具有良好的抑制效果［图6（C）和（D）］，在第7天出现持续性伤口闭合和结痂，分别占伤口面积的59.3%和58.3%，而对照组只有约40%.另外，这项工作还特别揭示了SAF-NCs诱导细胞膜破坏的机理，在大肠杆菌悬浮液中细菌细胞剧烈变形，显示机械应力诱导的细胞死亡［图7（E）］；对于金黄色葡萄球菌细胞，细胞结构的生物完整性被破坏，显示出典型的类膜破裂细胞死亡命运［图7（F）］.总的来说，这项工作强调了SAF-NCs的良好生物相容性以及显著的抗菌活性，预示了SACs在仿自然酶活性位点具有巨大的潜力.

Fig.6 Monoatomic zinc nanozyme system PMCS used for antibacterial wound healing[5]

Fig.7 Monoatomic iron nano systems SAF-NCs combined with light and heat for antibacterial therapy[34]

传统纳米酶存在活性位点密度低和催化机制复杂的问题［70，71］，增加活性位点密度和探究类酶活性的本源将有利于提高催化活性和理解催化本质.Huang等［6］报道了一种能模拟细胞色素P450的单原子纳米酶（FeN5SA/CNF）［图8（A）］，以Zn基MOF包裹铁酞菁（FePc）作为前驱体，在氮气氛围下经过900℃的热裂解得到具有FeN5/C位点的体系.对比于上文所述的Fe-N4位点，FeN5位点的形成理论研究表明，在MOF和铁酞菁的煅烧过程中四方平面FeN4位点被保留下来，而含氮有机配体的二级结构单元转化为吡啶氮碳纳米结构并随后与四方FeN4位点在碳纳米框架的限制范围内发生重建形成更具热力学稳定的FeN5/C位点［72］.作者发现这种FeN5位点类似于细胞色素P450的活性中心，具有显著的类氧化酶（OXD）活性，是金属含量正常的Fe-N4催化剂的17倍，并且不同中心金属原子对类酶活性也有不同的影响［图8（D）］.对FeN5SA/CNF的类OXD活性增强的催化机理进行DFT计算［图8（B）］表明，第一步的O2吸附是电子从活性中心转移到被吸附中间产物的活性的关键步骤.不同吸附构型的催化剂对O2的吸附能力（吸附能ΔG*O2）不同，FeN5的G*O2最高，强吸附削弱了O—O键使反应更容易进行，表现出最高的类OXD活性，而FeN4相对活性最低.此外，与MnN5相比，CoN5的G*O2相近而G*O较高，导致由*OOH向*O转变的势垒较高，因而MnN5更容易激活*OOH的O—O键［图8（C）］，催化活性更高.通过计算得知，类OXD活性的顺序为FeN5-SA/CNF＞MnN5-SA/CNF＞CoN5-SA/CNF＞FeN4-SA/CNF.体外抗菌实验表明，与对照组相比，经FeN5SA/CNF处理的大肠杆菌细胞的存活率明显降低，从SEM图像可以看出细菌受到严重损伤，细胞形态丧失，此结果与荧光染色一致［图8（E）］.此外，在高浓度（500μg/mL）的FeN5SA/CNF环境下，细胞系中未观察到明显的毒性［图8（F）］，表明FeN5SA/CNF是一种具有高度生物相容性的杀菌纳米酶.采用Balb/c小鼠的实际伤口感染模型评价FeN5SA/CNF的实际抗菌效果［图8（G）和（H）］，在治疗4天后，与对照组相比，FeN5SA/CNF治疗组小鼠的溃疡情况明显缓解，伤口愈合加速，苏木精和伊红（H&E）伤口切片染色也证明了这一点，角质形成细胞从正常组织转移到创面，治疗后正常皮肤表皮逐渐变得完整并增厚.这项工作为单原子纳米酶提供了另一个可行设计方案，为具有OXD活性的单原子材料的抗菌应用做出催化机理的解析.

Fig.8 Monatomic iron nanozyme system FeN5 SA/CNF mimics cytochrome P450 for wound healing in mice[6]

1.3 单原子催化剂在抗氧化领域的应用

氧化应激和许多疾病的发生发展有着密切联系，ROS或活性氮（RNS）物种的大量产生和积累会导致氧化还原稳态失衡［73］，因此开发能够防止或减少活性氧氮物种（RONS）产生从而缓解细胞氧化应激损伤的抗氧化剂具有重要意义.Li等［8］报道了一种单原子铁纳米体系（Fe-SAs/NC），通过将铁酞菁包埋在ZIF-8框架中，以热裂解的方式得到.实验表明，该体系具有类过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，可用于清除H2O2和·O2-以保护细胞免受氧化应激［图9（A）］.相比于没有单分散铁原子位点的纯ZIF-8热裂解体系（NC），单原子体系的产氧能力和·O2-清除能力更强［图9（B）和（C）］，这也证明了单原子铁在模拟CAT和SOD中的重要性.在与HeLa细胞共孵育后Fe-SAs/NC在胞浆中积累［图9（D）］，在β-拉帕酮［β-Lap，遇到HeLa细胞内高表达的NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）则被激活产生大量ROS］处理的细胞中，Fe-SAs/NC表现出优越的ROS清除能力［图9（E）］.进一步地，Lin等［35］通过机械和热裂解的方法合成了含有原子分散Fe-N4位点的单原子酶体系（Fe-N/C SACs），其表现出类过氧化物酶（POD），OXD，CAT和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等多酶活性［图9（F）］.作者基于材料的类CAT和GPx活性的特点进行了细胞水平上的验证，发现Fe-N/C SACs能有效清除HeLa细胞内ROS，保护细胞免受氧化应激［图9（G）］，并具有良好的生物相容性［图9（H）］.

Fig.9 Multi-enzyme activities of monatomic iron nano systems Fe-SAs/NC[8]and Fe-N/C SACs[35]

RONs能够干扰细胞信号传导、破坏生物分子和结构，进而引起细胞功能紊乱导致器官衰竭和死亡［74］.目前，大多数纳米酶用作抗氧化剂时存在催化活性相对较低且对·NO几乎没有清除能力的问题［75，76］.Qu等［36］开发了一种新的单原子酶（Co/PMCS）用于脓毒症治疗［图10（A）］，将Co掺杂到ZIF-8中形成Co，Zn共掺杂双金属MOF，然后在氮气流保护下经过900℃热裂解3 h得到Co/PMCS.Co/PMCS具有出色的RONs清除能力［图10（B）和（C）］，能够模拟SOD，CAT和GPx等多种酶而有效消除H2O2和

·O2

-［图10（D）～（F）］；同时通过氧化还原循环有效地降低·OH；最重要的是，该体系可以通过共卟啉中心的协同作用有效清除·NO.体内实验表明，在LPS诱导的小鼠脓毒症模型中，Co/PMCS静脉给药组在第14天后，促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平均显著降低［图10（G）］，肝细胞损伤程度以及肾功能损害程度也恢复到正常水平，表明Co/PMCS可以有效降低炎症水平，恢复脓毒症小鼠的多种机体功能.在大肠杆菌诱发的菌血症小鼠模型中，与用PBS处理的对照组对比，Co/PMCS处理组的促炎因子水平显著降低［图10（H）］，小鼠的肝、肺、肾、肠和血液中的细菌数明显更低［图10（I）］，同样说明了该单原子体系的抗氧化缓解炎症的能力.这项工作增强了应用单原子纳米酶对抗氧化应激相关疾病的信心.

外伤性脑损伤后会原位产生大量RONs，引发一系列生化反应和神经炎症，导致神经元长期损伤［77］.为了解决这个问题，Zhang等［37］通过在CeO2纳米簇上荷载Pt单原子开发了单原子Pt/CeO2纳米酶绷带［图11（A）］，Pt/CeO2表现出多酶活性［图11（B）］.DFT计算结果表明，Pt单原子更倾向于稳定在CeO2（111）晶面上并诱导晶格膨胀和择优分布，显著提高了CeO2的内生催化活性［图11（C）］.通过比较束缚在Pt/CeO2（111）晶面上的自由基的能量与未束缚在Pt/CeO2（111）晶面上的自由基和自由基单元的自由能总和，计算体系的能量差.·NO和·OH被吸附在Pt/CeO2（111）晶面的能量差分别为0.16和0.13 eV，相对较低的能量差表明Pt/CeO2体系对这些自由基具有较高的催化活性.相比之下，ONOO-和·O2-分别显示出0.24和0.28 eV的相对高能量差，表明催化过程中的相对高能量消耗［图11（D）］.Pt/CeO2纳米酶的RONs清除效率检测结果显示，该体系对ONOO-，·OH和·NO的清除率分别达到86%，100%和100%，而对CeO2簇的清除率仅为36%，37%和19%［图11（E）］，这些数据与上述能量差计算结果符合，也证明了单原子Pt在催化剂中的重要作用.体外抗炎活性测试表明，Pt/CeO2可以降低由H2O2诱导的炎症因子，包括白细胞介素IL-1β，IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α［图11（H）］，这说明纳米酶绷带能降低神经元细胞氧化应激和炎症反应指标.从动物层面看，治疗8天后伤口大小和面积在接受绷带治疗后均显著减少至健康水平，而未经治疗的小鼠仅表现出50%的恢复［图11（F）和（G）］.这项工作为单原子催化用于非侵入性治疗TBI提供了一个可行的范例.同时，上述几个关于单原子策略抗氧化的范例也为SACs在生物医学和氧化应激相关疾病（如神经退行性疾病、关节炎及脑中风等）的治疗提供了可行的策略及前瞻性实践.

Fig.10 Monoatomic cobalt nanozyme system Co/PMCS used for the treatment of sepsis and bacteremia[36]

Fig.11 Monoatomic platinum nanozyme bandage Pt/CeO2 for the treatment of traumatic brain injury[37]

1.4 单原子催化剂在生物传感中的应用

选择性和灵敏性是评价生物传感器的重要指标，SACs的高选择性和高催化活性优势有利于开发生物传感器.Lin等［38］通过900℃热裂解Fe（acac）3@ZIF-8得到了单原子纳米酶体系（Fe-N-C SAN），表现出高达57.76 U/mg的比活性，这与HRP表现相当.以对苯二甲酸（TA）作为荧光指示剂，二氢乙啶（DHE）作为荧光探针分别证实了Fe-N-C SAN的类CAT和OXD活性［图12（A）和（B）］.作者基于SACs的高催化活性和稳定性，将Fe-N-C SAN应用于丁酰胆碱酯酶（BChE）活性的高效检测，开发了一种用智能手机集成的纸上生物测定法，可更便捷地检测BChE活性［图12（C）］.类似地，Huang等［39］开发了一种尺寸可控的Fe-N/C纳米酶，基于该体系的类OXD活性实现了碱性磷酸酶（ALP）的高敏检测.在ALP存在下，抗坏血酸2-磷酸酯（AAP）水解生成抗坏血酸（AA），而AA能有效抑制TMB的氧化［图12（D）］.他们据此原理开发了一种新的比色分析方法，制备了一种新型的ALP活性筛选比色生物传感器平台，实现了0.05～100 U/L（4个数量级）范围内的ALP高敏检测［图12（E）］.

Fig.12 Monatomic iron nanozyme system Fe-N-C SAN used for butyryl cholinesterase(BChE)[38]and Fe-N/C for alkaline phosphatase(ALP)detection[39]

二维（2D）材料在生物传感领域有广阔的应用前景［78］，Lin等［40］以FeCl2、葡萄糖和双氰胺为前驱体，通过高温煅烧制备了具有类POD活性的2D单原子酶（Fe-N-C SAzyme）［图13（A）］，实现了超灵敏和高选择性地原位检测活细胞H2O2.检测过程中，佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）作为H2O2诱导剂被用来刺激HeLa细胞产生H2O2，单原子酶的Fe-Nx活性位点能有效催化H2O2生成·OH，而·OH将TMB氧化成oxTMB被监测，最终完成Fe-N-C酶对HeLa细胞产生的H2O2的原位检测［图13（B）］）.该体系通过典型的比色法应用于H2O2的超灵敏和特异性检测.实验发现与100 mmol/L H2O2相比，浓度为500 mmol/L的Zn2+，Mn2+，Ca2+，葡萄糖和抗坏血酸（AA）等均未引起明显的颜色变化，表明Fe-N-C酶对H2O2的检测具有良好的选择性［图13（C）］，且在0.5～100 mmol/L范围内，H2O2浓度与吸光度值之间呈良好的线性关系，表明其较高的灵敏性［图13（D）］.同样是类POD活性，Du等［41］开发了一种基于铁原子锚定在N掺杂碳纳米管上的单原子纳米酶体系（CNT/FeNC）［图13（E）］.该体系充分暴露的Fe-Nx-C位点以及原子分散产生的尺寸效应为其提供了显著的类POD活性，可实现5 min内以135次循环的周转数催化H2O2生成·OH，比传统的Fe3O4纳米酶高出约4500倍.此外，纸张荷载的单原子分散CNT/FeNC体系（SDCP）被开发为一系列生物测试的信号元件，用于H2O2，葡萄糖和抗坏血酸的超灵敏检测［图13（F）～（H）］.抗干扰测试实验结果表明，SDCP在生物测定上具有优越的选择性.这两项工作展现了SACs在传感领域的巨大应用潜力.

Fig.13 Single atomic iron nanozyme system Fe-N-C[40]and CNT/FeNC[41]for sensitive detection

Lee等［42］在石墨烯中嵌入Fe-N4位点，合成了具有仿天然HPR中血红素辅因子的单原子纳米酶体系（Fe-N-rGO）［图14（A）］，其POD催化速率是未嵌入Fe-N4位点石墨烯的约700倍［图14（B）］，且Fe-N4位点可选择性地提高类POD的活性，而不增强其它类酶活性［图14（C）］.作者基于Fe-N-rGO对H2O2出色的选择性和敏感性，将其应用于乙酰胆碱（Ach）和癌细胞定量测试.对Ach检测的线性范围为50～1000 nmol/L，检出限（LOD）低至20 nmol/L［图14（D）］；在测定人血清中Ach含量时结果与Ach的添加量一致，变异系数范围为2.4%～4.0%，回收率为98.8%～108.9%.对于H2O2的检测，以能在N-甲酰甲基-亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP）刺激下产生H2O2的3个细胞株为模型，通过吸收强度计算在一定量fMLP刺激下每个细胞产生的H2O2的含量［图14（E）和（F）］，最终定量检测同样含量fMLP刺激下的细胞数以完成对细胞数的检测.最近，Wu等［43］报道的单铁位点纳米酶（Fe SSN）能有效将H2O2活化为·OH，从而实现对葡萄糖的高灵敏检测.他们采用“牺牲模板法”，即先将MgO与铁前驱体和有机配体混合得到Fe（phen）x/MgO，在高温热裂解后通过酸洗除去MgO，最后得到Fe SSN［图15（A）］.如图15（B）所示，在H2O2存在下，Fe SSN可有效氧化TMB得到蓝色ox-TMB，联合葡萄糖氧化酶（GOx）发生级联催化反应以实现对葡萄糖的高灵敏检测.更具实际意义的是，他们通过将级联反应各要素嵌入琼脂糖基的水凝胶开发了一款生物传感器，使葡萄糖的检测更加可视化［图15（C）］.

通过上面6个单原子在生物传感的应用实例可以发现，研究者均利用了单原子铁中心的催化活性，而其它金属单原子体系则鲜见报道，因此在生物传感方面SACs尚存在待挖掘的潜力.

Fig.14 Monatomic iron nanozyme system Fe-N-rGO used for quantitative testing of acetylcholine(Ach)and cancer cells[42]

Fig.15 Single iron site nanozyme for ultrasensitive glucose detection[43]

2 总结与展望

本文综述了SACs生物医学应用领域，包括肿瘤治疗、抗菌、抗氧化和生物传感等方面的最新进展.SACs之所以能在生物医学领域受到足够的关注，与其自身的低配位环境和电荷转移效应、充分暴露的活性金属中心、高催化活性与选择性、高原子利用率、结构上的精细性以及对催化机制研究的简便性等优势密不可分.综述实例也预示了SACs在生物医学领域巨大的潜在应用前景，但目前仍存在如下挑战：

（1）已报道的大多数具有类酶活性的SACs局限于碳基纳米催化剂［79］，SACs的主要合成方法仍是热裂解法，经过高温煅烧的材料特别是碳材料的水溶性、生物相容性较差，需要经过强酸或碱进一步处理活化或经PEG等进一步修饰［31］，这会对催化剂原有结构造成一定的破坏且不能获得足够理想的活性位点，但同时，支撑材料通常表现出很好的酸碱稳定性，预示着在肠胃疾病方面的潜在应用.

（2）尽管目前已报道了多种用于生物医学领域的SACs，但普遍缺乏对于纳米体系的药代动力学以及毒理学的研究，仅停留在较为表面的材料活性以及应用效果层面，这不利于SACs的全面评价和临床转化.希望科学家们能够重视SACs的“一切行为”，当然这还有很长的路要走.

（3）MOF作为一种相对新型的多孔材料，在诸多领域均展现出巨大的应用前景［80］，鉴于Wang等［30］利用贵金属部分取代MOF节点金属得到单原子体系的研究，因此未来可在MOF方向开展更多的工作，一方面可避免热裂解带来的问题，另一方面MOF种类的多样性为设计更多符合需求的单原子体系提供了可能，但仍然要考虑到稳定性以及高荷载等问题.

（4）单原子策略为寻找高活性和高选择性的纳米酶提供了合理的新途径，尽管目前SACs的生物医学应用还处于初级阶段［79］.如主要应用于肿瘤治疗、抗菌和生物传感等领域，而在抗炎、成像诊断、免疫治疗、联合治疗及神经退行性疾病等方面的报道甚少.如何合理利用金属与材料的特性整合各自性质开发多功能或多模式成像等材料是值得考虑的问题.

（5）目前应用于生物医学领域的主要为Fe，Au和Zn基SACs，特别是M-Nx-C纳米结构，且在生物传感方面多为碳基的单原子铁纳米体系，而对稀有金属、半金属或贵金属原子催化剂的研究则较少，预计贵金属以单原子分散存在时可能衍生出更显著的性能，这需要进一步探索.另外，SACs最大限度地提高了金属的原子效率，这为稀有贵金属的高效利用提供了有利条件，因此，开发贵金属原子SACs用于生物医学领域具有广泛的前景.

（6）用于生物医学领域的SACs的金属原子负载量目前仍有很大的提升空间，开发更加合理高效的合成方法是未来努力的一个方向［81］.同时，还应该考虑支撑材料的尺寸问题，因为随着尺寸的减小，金属物种的自由能会进一步增大，分散原子聚集的趋势增大，因此在克服原子聚集的基础上最大程度地提高负载量还需进行大量尝试.另外，杂原子（硼、硫等）掺杂以及多金属掺杂的SACs在生物医学上报道甚少，合理取舍将能发挥最大的功效.

（7）SACs中暴露的、精确的活性位点为精确的理论计算以及更好地理解物质之间相互作用的本质提供了理想的平台.然而，在进行DFT计算的时候也应注意到金属原子需要被均匀地负载到支撑材料上，在这个问题上，由于2D材料在表面积以及电子转移方面具有独特的优势［17］，能作为一个良好的平台，在未来的SACs设计中应予以重视，如黑磷、硼烯等.

（8）在临床转化上，生物安全性以及生产规模化是需要考虑的重要问题，改善材料的生物相容性和生物可降解性将会是未来突破的重点.研究不应仅停留在实验室阶段，克服一切困难推动实验成果向临床转化还有很长的路要走.