发酵肉制品中凝固酶阴性葡萄球菌的应用研究进展

王松，郭柯宇，唐林，杨勇，刘书亮*

1(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014) 2(宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾，644000)

传统发酵肉制品生产采用自然发酵，微生物来自于原料和环境，在特定腌制和成熟工艺条件下，通过相互竞争形成典型本地微生物群落，从而显著影响产品的质量和安全[1]。人工发酵剂的广泛使用极大地促进了规模化生产的发展，满足庞大消费市场对发酵肉制品的需求。然而，千篇一律的商用发酵剂使用造成了各地区传统发酵肉制品典型风格逐渐弱化并趋同，规模化产品在消费者心中形成了单一的、乏味的，甚至是不安全的市场形象[2]。针对这一问题，功能性肉类发酵剂引起了越来越多研究者的兴趣。这种新型发酵剂是由本地自然发酵产品中精心筛分的、具有多种新型功能的菌株组成，除了传统发酵剂的基本酸化和显色活性外，更重要的是能够提高发酵肉制品风味、色泽、安全、健康多方面性能[3]。凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci, CNS)是发酵肉制品中主要微生物类群之一，大量研究已经证明其在加工生产中具有重要作用，是功能性发酵剂的重要组成部分[4]。本文综述了发酵肉制品中CNS的多样性及其动态变化影响因素，CNS在发酵肉制品生产中的技术性能和潜在安全隐患，提出了新型功能CNS菌株的开发策略，为开展本地CNS菌株的应用研究和促进传统发酵肉制品产业发展提供基础信息。

1 发酵肉制品中的CNS

1.1 发酵肉制品中CNS多样性

传统发酵肉制品均是在自然环境条件下经历了长时间的脱水和成熟，不同来源的多种微生物富集于肉基质中代谢繁殖，数量可达107～109CFU/g，其中乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)和CNS是最主要的细菌群落[5]。LAB是研究最多的一类微生物，清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)是最常见的肉制品LAB[6]。然而有研究表明[7]，在发酵肉制品中CNS的多样性比LAB丰富，其多样性和动态变化过程越来越受到研究者的重视。如木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)是欧洲传统发酵香肠中最具优势的种类[8-9](表1)，而S.xylosus、S.saprophyticus、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)等在中式发酵肉制品中更具有优势[10-11]。S.xylosus和S.carnosus因具有较好的硝酸盐还原作用、产香能力和安全性能成为最普遍的工业发酵剂菌种。除上述外，小牛葡萄球菌(Staphylococcusvitulinus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcussuccinus)、华纳葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)等也是发酵肉制品中常见的种属，这些充分展示了肉中CNS的多样性。另外，即使是同种内也存在大量的表型和基因型多样性，比如S.equorum和S.saprophyticus显示较高的种内遗传多样性，而S.xylosus种内遗传多样性低[9]。

1.2 影响发酵肉制品CNS群落动态变化的因素

CNS群落在发酵肉制品中受到包括原辅料、加工过程、加工条件等一系列复杂因素的影响，目前仍未能完全解析其动态变化规律。比如LEROY等[18]发现S.equorum在所有环境和肉样中均有分布且比例均匀，S.saprophyticus在环境和肉样中均有分布，但环境样品中含量更高，S.xylosus在部分环境和肉样中存在，且肉样中含量更高。温度、pH、烟熏等加工工艺对葡萄球菌的动态变化影响比原料更大。研究显示S.carnosus在原料肉(如猪肉)中一般很少存在，但由于其在高盐含量和低pH (pH<5.5) 的肉基质中具有更好的竞争优势，反而成为肉制品中优势种群，尤其是高酸化的发酵香肠中[19]。S.xylosus更适合低温与温和的酸度条件，S.epidermidis更适应较高温度的环境条件，而S.carnosus更适应较低pH的环境条件[20]。S.saprophyticus是烟熏产品中优势种属，但成熟过程会逐渐消耗前期代谢积累的乳酸等有机酸，引起pH值升高，导致优势种群向S.equorum转变，因为后者对低酸性的环境更加适应[21]。另外，不同加工类型产品中主要优势菌群也有差异，LANDETA等[22]研究西班牙香肠和火腿中CNS发现，S.carnosus在香肠中是主要菌群，而S.equorum是火腿中的主要菌群。

表1 部分中西式发酵肉制品中CNS优势种属Table 1 Dominant species of CNS in parts of Chinese and Western fermented meat products

2 CNS在发酵肉制品生产中的技术性能

2.1 硝酸盐还原

2.2 风味形成

CNS的代谢活动对风味的形成至关重要，分为4种主要的作用模式[28]：(1)碳水化合物发酵；(2)氨基酸转化反应；(3)脂质β氧化；(4)酯酶活性。肉中主要是LAB发酵碳水化合物产生乳酸，引起肉基pH值下降。然而，CNS也能够在一定程度上代谢碳水化合物，并将其转化为有机酸(主要是乳酸和醋酸)以及挥发性化合物，如双乙酰、乙醛、乙偶姻等，可以带给干发酵香肠奶油味或奶香味[29]。除了碳水化合物代谢外，CNS代谢氨基酸产生具有低阈值的挥发性成分对发酵肉制品风味更有决定性的作用。动物死后，肌浆蛋白和肌纤维蛋白可被肌肉蛋白酶和肽酶水解。除了这些内源酶外，CNS的外源蛋白酶活性也很明显，尤其是肽的水解及其转化为游离氨基酸的酶活性，这可能占到总蛋白水解的40%，肽和游离氨基酸都可以通过额外的反应形成挥发性和非挥发性化合物[30]。CNS可以将支链氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通过转胺或脱羧形成相应的支链醛、羧酸和醇，比如来源于亮氨酸的化合物3-甲基丁醇、3-甲基丁醛和3-甲基丁酸常与发酵香肠的香气联系在一起[31-32]。同样，脂质水解主要也是内源性脂肪酶作用于脂类物质完成的，但CNS的外源脂肪酶也有一定的作用[33]。脂类水解释放出的脂肪酸可以被CNS产生的外源性脂肪酶通过不完全β氧化降解成ketoacyl-CoA，再在硫酯酶的作用下脱去酰基形成β-酮酸、短链游离脂肪酸和CoA。CNS可进一步将β-酮酸经脱羧作用后生成肉制品典型风味成分甲基酮，如2-戊酮、2-己酮、2-庚酮等[34]。另外，这些甲基酮可以进一步转化为仲醇，CNS的酯酶活性还可以将相应的醇和酸进一步反应，生成芳香酯化合物[35]。

2.3 抗氧化活性

肉类产品的氧化可使脂质和蛋白质降解，而过度氧化则导致最终产品的颜色，质地，风味和营养价值的降低。脂质过度氧化可导致形成与不良风味相关的醛，酮和羧酸等物质[36]，蛋白质过度氧化可导致羰基化合物和蛋白质聚集体的形成，进而降低肉制品成熟过程中蛋白水解作用，或者直接损害蛋白水解酶如半胱氨酸蛋白酶的活性，减少游离氨基酸产生和进一步转化，降低肉制品品质[37]。发酵肉制品中的CNS具有较强的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶的活性，SOD将超氧自由基解毒成反应性较低的过氧化氢，再被过氧化氢酶转化为水和氧气，减缓肉制品的过度氧化过程。目前的研究表明，大多数CNS至少具有1种过氧化氢酶活性，一部分种属如S.carnosus、S.saprophyticus、S.equorum存在2种过氧化氢酶活性[38]。VERMASSEN等[39]发现木糖链球菌存在多达3种过氧化氢酶活性，当在肉基质中加入亚硝酸盐后，S.xylosus抗氧化活性的编码基因在亚硝化胁迫下显著上调，抗氧化活性增强。

3 潜在的安全隐患

食源性CNS菌株与临床CNS菌株种间和种内的遗传相似性极低，发酵肉制品中CNS的代谢活性通常不会引起安全隐患，目前商业菌株S.xylosus和S.carnosus被认为是安全的[40]，我国在2016年把S.xylosus、S.carnosus和S.vitulinus列入可用于食品的菌种名单[41]。西方肉制品加工业开始逐渐认可S.equorum应用于工业生产[22]，另外一些种属如S.saprophyticus、S.epidermidis、S.simulans的特定菌株也被应用于生产实验中，并表现出稳定的安全性能[17,42]。但是，CNS的某些菌株可能仍然表现出威胁食品安全的不良特性，在作为人工发酵剂添加时，由于人为增加菌体浓度，可能会放大这些不良特性的威胁[40]。因此，对CNS进行安全性评估是重要且必需的，尤其是在将其用作食品发酵剂时，需要采取逐案处理的方法[43]。目前对CNS菌株安全性评估工作主要包括是否能够产生生物胺、是否具有毒力因子、是否具有可转移的抗生素抗性等。

3.1 产生生物胺

过量摄入生物胺可对人体产生负面的生理影响，当肉制品中的生物胺含量高于 200 mg/kg 时，可能会导致食物引起的偏头痛和高血压。CNS菌株通常存在氨基酸脱羧酶活性，因此可能具有产生生物胺的能力，研究结果[44]也证实部分CNS菌株能够产生低浓度的生物胺，且不同种属和不同菌株之间的水平有所不同。如STAVROPOULOU 等[45]发现在营养丰富的培养基中孵育48 h后，不同CNS物种的生物胺浓度大多仍低于100 μmol/L，其中S.carnosus所产生的2-苯乙胺是含量最高的生物胺类，但其浓度含量仍然在安全范围之内。目前，肉制品中受到生物胺风险的例子极少，但当有其他产生物胺细菌污染时，仍具有相当的风险，确保所用发酵剂菌株不产生物胺仍是非常必要的。

3.2 毒素因子

CNS的另一个潜在安全风险是可能产生葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins, SE)，目前至少有23种血清学上不同的肽，并且对热和大多数蛋白水解酶具有抗性[4]。科学家们对金黄色葡萄球菌SE进行了深入研究，但仍然对CNS肠毒素引起的食物中毒存在疑惑。TALON等[40]指出迄今为止尚无关于仅涉及CNS菌株的食物中毒的报道。PODKOWIK等[46]在32株S.epidermidis中发现8株菌有编码SE的基因，其中1株菌的编码基因可以进行稳定遗传，并进一步证明该编码基因在包括肉汤在内的多种食品中可以表达并产生金黄色葡萄球菌同源SE。因此，用于发酵肉制品的CNS菌株必需确保不产任何SE。

3.3 抗生素耐药

抗生素耐药的编码基因(例如blaZ，tetK，tetM，lnuA，ermB和ermC)常常位于可转移或可移动的质粒上，从而使抗生素耐药成为应用于食品发酵细菌的主要安全风险[12]。发酵肉制品CNS中包含可转移的抗生素耐药基因通常对青霉素、红霉素、四环素和林可霉素具有耐药性，成为人体细菌耐药基因的储存库和载体[47]。CNS的抗生素耐药型与菌株来源无关，不同种属、不同菌株之间可以表现出较大的差异，如一些菌株表现出完全缺乏抗药性(56%)，而另一些菌株(2%～7%)可能对多达6种抗生素具有抗药性[13]；又如S.xylosus的多重耐药比较少，而S.epidermidis的多重耐药比较多[14]。文献报道最多的抗生素耐药CNS是S.xylosus和S.carnosus，当然这与这些商用菌株研究比较多有关，但也侧面反应了目前这些商用菌株耐药基因比例逐渐升高，迫切需要找到新的商用菌株。而自然发酵肉制品中的抗生素压力较低甚至没有，是优良菌株的重要来源。

4 新型功能性CNS的筛选策略

合理筛选具有特定功能的CNS菌株将有助于针对性地改善发酵肉制品的质量和安全性能，满足消费者和生产者迫切需求。针对现阶段工业生产存在问题，着重筛选可以改善最终产品的风味、颜色、生物安全的CNS菌株，以及加工过程中在肉类基质具有竞争优势的菌株，应用于生产提升产品品质与安全。

4.1 增强竞争力

一部分CNS菌株能够在肉类基质碳水化合物水平较低时(10～20 mg/g)利用其他替代能源，比如核苷和精氨酸，从而在不同程度上增强其竞争优势[48]。这种竞争优势对CNS在肉类基质中实现其功能特性是极其重要的，因为只有菌体细胞生长发展到足够的数量，表达的功能特性才能对产品产生显著性影响。

动物机体死亡后，肌肉细胞中腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)可以自动分解释放出腺苷和肌苷，浓度可以达到300 mg/100 g肌肉，这些核苷可以通过特定的转运蛋白吸收到细菌细胞中，被菌体细胞内核苷水解酶分解形成核糖，当肉基中其他碳源和能源不足时，这些核糖可以作为替代能源被肉中CNS代谢[49]。JANSSENS等[48]验证了分属于17个种的61株CNS菌株利用核苷代谢情况，证明了代谢利用核苷是CNS菌株的普遍能力。除此以外，CNS还拥有利用精氨酸作为替代能源的能力。精氨酸大量存在于肉中，可达到6 mg/100 g肌肉，且随着肉制品加工过程可增加到原浓度的3倍。由图1[4]可知，细菌通过精氨酸脱亚氨基酶(arginine deiminase，ADI)途径将1 mol精氨酸转化为1 mol鸟氨酸、1 mol CO2、2 mol NH3和1 mol ATP[50]，该途径产生的ATP和NH3可以提高细菌在发酵食品中竞争优势[4]。ADI途径在CNS中的表达活性在种和菌株2个水平上均存在显著差异[48]：种水平上，S.carnosus、S.condiment、S.epidermidis、S.haemolyticus、S.hyicus、S.saccharolyticus和S.simulans普遍具有ADI活性，而S.lugdunensis、S.lutrae、S.sciuri和S.succinus中则较少出现；菌株水平差异较多出现在S.auricularis、S.hominis、S.intermedius、S.pasteuri,S.saprophyticus和S.Warneri中。JANSSENS等[48]还发现ADI途径处于多种调控水平，表达活性在菌株水平上观察到的差异还常常受到外界环境因素的影响，甚至可能导致其转换为其他精氨酸代谢途径，如当生物量较低时，ADI表达活性似乎受到了阻碍，有氧运动可能导致某些菌株向精氨酸酶活性的转换，后者是精氨酸转化的替代途径，导致鸟氨酸和尿素形成。

尽管目前这些替代能源代谢机制尚未完全搞清楚，其代谢作用对CNS在肉基质中竞争优势是否起着显著作用，以及这种代谢能力在不同菌株间是否存在显著性差异还需要进一步研究。但精心筛选在特定肉基质中具有较强竞争优势的菌株，有助于新型发酵剂更好地表达功能特性，显著改善产品质量与安全。

ADI-精氨酸脱亚氨基酶；OTC-鸟氨酸甲酰基转移酶；CK-氨基甲酸激酶；NOS-一氧化氮氧合酶图1 凝固酶阴性葡萄球菌中精氨酸代谢途径Fig.1 Pathway of arginine metabolism in coagulase-negative staphylococci

4.2 颜色产生

如前所述，CNS普遍具有硝酸盐还原酶活性，但硝酸盐还原酶活性在CNS不同种之间和同一种属不同菌株之间均存在较大差异。比如S.carnosus、S.xylosus、S.equorum、S.lentus、S.simulans、S.sciuri和S.succinus常具有较强的硝酸还原酶能力，而S.saprophyticus、S.succinus和S.warneri通常不存在硝酸盐还原酶活性。BOSSE等[25]发现接入硝酸盐还原酶活性较强的S.carnosus可显著减少火腿中硝酸盐残留量，增加亚硝酸盐含量；而接入酶活力较弱的S.carnosus则相反。MAINAR等[27]在添加2.96 mmol/L硝酸盐的肉模拟培养基中评估88株CNS，发现其中78个菌株具有硝酸盐还原酶活性，但只有35株菌表现出较高转化活性，分属于S.carnosus、S.epidermidis、S.equorum、S.pasteuri和S.xylosus。另一方面，添加具有硝酸还原酶活性的CNS菌株并不能确保肉制品良好色泽的形成，加工工艺条件对色泽的形成同样具有重要的影响。研究表明CNS的硝酸盐还原酶活性一般是在硝酸盐存在的情况下由厌氧环境条件诱导，且在指数生长期间达到最大，只有适宜加工条件使菌株形成竞争优势，才能最大化的表达其硝酸盐还原酶活性[24]。GOTTERUP等[26]确认CNS的硝酸还原酶活性不能直接预测香肠制品中亚硝基肌红蛋白的形成率，菌株良好颜色形成能力的预测还应包括生长特性和耐酸性等其他相关特性。

近年来，科学家们提出CNS还可以通过一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)途径代谢精氨酸产生Nω-羟基-精氨酸中间产物，随后形成NO和瓜氨酸(图1)。RAS等[51]验证了S.xylosus中确实存在nos基因，并发现大多数CNS菌株中都含有nos基因，推测其在CNS中高度保守，但是表达并产生的NO无法形成足够的亚硝基肌红蛋白，反而更多的是形成氧合肌红蛋白，且在种和菌株间存在较大变异[52]。从理论上讲，发酵肉制品中细菌NOS途径可用作NO的替代产生途径，用来减少硝酸盐和/或亚硝酸盐在肉制品生产中的使用。然而，细菌NOS途径更多的是用于抵御氧化应激，其所产生的NO是否能够用来合成足够的亚硝基肌红蛋白，进而在生产中替代亚硝酸盐还缺乏足够的研究[53]。MAINAR等[27]研究17个种的86株CNS发现，只有1种菌株显示NOS活性且活性较弱。现有证据表明，基于NOS的肉制品良好色泽形成还有很多科学问题需要解决，但仍为寻找合适的亚硝酸盐替代开辟了新的方向。

4.3 风味强化

风味是肉制品最重要的质量属性，如前所述，CNS的生长代谢作用可以将肉中的碳水化合物、氨基酸和脂肪酸代谢转化，产生一系列挥发性物质，从而改善产品风味。目前商业菌种S.xylosus和S.carmnosus在风味形成方面的作用研究很多，S.xylosus菌株更适用于发酵香肠生产，所产生的芳香族风味物质可以为产品带来更加圆润的风味，而S.carmnosus可能比其他CNS产生更多的甲基酮以及支链醛和醇类，导致成熟时间更快[54-55]。尽管如此，仍需要更多研究来弄清哪种发酵剂更适合某一特定类型的发酵肉产品，以及硝酸盐添加量，发酵时间、发酵温度，盐含量和发酵剂浓度等工艺差异对风味的影响[19-20, 32, 56]。已有学者对CNS在蛋白质和脂肪降解、风味物质产生等方面的种间和种内差异性进行了大量研究，除了现有商用发酵剂外，一些CNS种属如S.equorum、S.saprophyticus、S.sciuri、S.warneri和S.simulans的部分菌株也展示了良好的挥发性风味物质生产潜力，可为系统评估发酵肉制品的本地CNS群落和筛选优良风味功能CNS菌株奠定了重要基础[42]，如S.saprophyticus和S.warneri在一定的生产条件下，生产乙偶姻、二乙酰、乙酸等重要风味成分的能力可以达到甚至超过商业发酵菌株S.xylosus的水平，而S.carnosus则几乎不产这类风味物质[45]。可以肯定的是，自然发酵过程利用本地野生型菌株的特定代谢作用，能够为产品带来诱人的独特香气，近年来分子技术和发酵技术的进步为我们重新评估这些本地野生型菌株提供了可能[57]。因此，筛选本地野生型风味改良菌株作为新型功能发酵剂可能是改善产品风味的有效途径。

4.4 生物保护

筛选产细菌素的菌株作为发酵剂用于肉制品生产，提高产品对有害微生物的抵抗作用，保障发酵正常进行，减少致病菌的危害，成为肉制品功能发酵剂研究的重点[58]。近年来，肉制品发酵剂中另一种重要微生物LAB在这方面有大量的研究，对细菌素的功能、微生物产细菌素的机理和功能微生物的筛选等相关内容进行了较为深入的阐述，本文在此不再赘述。现有的研究表明，CNS菌株同样具有产生细菌素的能力，且与LAB不同的是，部分CNS细菌素展示了对梭状芽孢杆菌和/或金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性[59]。加强CNS产细菌素方面的研究工作，筛选产细菌素CNS与产细菌素LAB(对李斯特氏菌有较好的抑制作用)联合作为发酵剂应用于肉制品生产，可以更好地提升产品的质量和安全，在工业生产中适量减少硝酸盐/亚硝酸盐的用量。

5 结束语

随着发酵工程和分子生物学的不断发展，古老的传统肉制品行业也在不断进行技术创新，以适应现代化生产的需求，提高产品感官特性和食品安全性，满足消费者需求。目前，对CNS的研究主要关注了商用菌种S.xylosus和S.carmnosus增强风味和稳定色泽等常规技术性能方面的作用，然而对CNS在不同肉制品生态中的多样性及其功能代谢差异还研究不多。开展本地CNS的生态学研究，将工业生产需求和传统肉制品特定风格需求结合起来，有针对性的筛选功能性CNS发酵剂菌株，例如增强特定风味、显著改善颜色形成、提高生物安全性等，将其应用于传统肉制品的大规模生产，满足生产和消费两方面的需求。