农药生产企业浅层地下水污染物的生物毒性诊断*

余晓燕 余佳龙 冯立峰 童飞鹏

(1.杭州经济技术开发区环境监测站，浙江 杭州 310018；2.浙江环茂自控科技有限公司，浙江 杭州 311121；3.杭州市生态环境局钱塘新区分局，浙江 杭州 311225)

当前，场地地下水的污染调查诊断主要是对地下水中部分污染物含量的化学分析，由于场地污染的复杂性，很多情况下化学诊断并不能全面反映场地受污染的情况及各种有毒有害物质对周边环境或生物的综合影响，生物毒性诊断技术可以弥补这一缺陷。周艳等[1]700对某有机污染场地浅层地下水的生物毒性研究发现，斑马鱼胚胎毒性试验灵敏度高于成鱼急性毒性试验，可用于污染场地水样毒性的快速诊断。王超等[2]利用蚕豆根系细胞微核试验发现自来水出厂水潜在致突变性较原水强，主要原因为化学消毒剂与水源水中有机物形成了一系列低浓度但具有致突变性的消毒副产物。宋晓威等[3]选择大型蚤、斜生栅藻、发光菌为试验生物，对某废弃农药厂污染场地不同区域浅层地下水进行了化学和生物毒性分析，发现毒性试验结果与化学检测结果有较好的相关性，3种受试生物的毒性效应结果一致。针对污染场地或潜在污染场地，现有的研究认为生物毒性诊断技术是化学诊断的有益补充[4-6]。但必须指出的是，作为一项应用于场地污染识别的实用技术，它应同时具备以下特征：有国际或国家标准支撑，易于操作，耗费较低。经济合作与发展组织制定了针对化学品生物毒性效应的标准与工作指南[7]，我国于20世纪90年代参照国际标准也已制定了蚤类(大型蚤)、发光细菌等水质急性毒性测定方法[8-9]，在2019年颁布了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法[10]。

本研究涉及的两家在产农药生产企业厂区土壤质地为砂质粉土，土壤有机质质量分数仅为0.1%～0.4%，一旦土壤被污染，地下水极易受到影响。本研究以厂区浅层地下水为研究对象，采用发光细菌急性毒性试验和斑马鱼胚胎毒性试验初步诊断场地浅层地下水的生物毒性，以期为在产企业的危害识别、风险评估以及污染防治提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

研究区域为相邻的2家农药生产企业，企业A主要生产氟虫腈和乙虫腈，企业B主要生产炔螨特、氟节胺、丁硫克百威等，均位于杭州。由场地调查取样专业公司采用美国Geoprobe Direct Push取样系统，根据美国材料与测试协会(ASTM)制定的相关技术导则进行操作并建井。企业A在靠近合成区域、焚烧炉、罐区、制剂车间的地方各设一口监测井，分别标为A01、A02、A03、A04，企业B在靠近两个合成车间生产区域的地方各设一口监测井，分别标为B01、B02(见图1)。A01建井深度8 m，其余均为6 m。洗井后采样，用于化学分析以及生物毒性诊断。现场观察A04地下水有气泡，B01地下水有刺激性气味。地下水埋深较浅，采样期间地下水埋深为0.65～1.14 m，属第四系潜水类型。

1.2 生物毒性诊断

发光细菌急性毒性诊断参考文献[9]进行，发光细菌冻干粉购自中科院南京土壤研究所，采用30 min的暴露时间。生物毒性分为4级：Ⅰ级(低毒或无毒)，原样抑制率低于30%为无毒，抑制率30%～50%为低毒；Ⅱ级(中等毒性)，原样抑制率高于50%，原样稀释10倍后，抑制率低于50%；Ⅲ级(高毒)，原样稀释10倍后，抑制率高于50%，但稀释100倍后抑制率低于50%；Ⅳ级(强毒性)，原样稀释100倍后抑制率仍高于50%。

斑马鱼胚胎毒性试验参照文献[7]进行。挑选发育正常的受精卵在2.5～3.0 h(囊胚期初期)进行暴露试验。在细胞培养板中开展试验，每孔加入2 mL水样和1枚随机选取的正常受精卵，(26±1) ℃下，每天按照14 h光照加10 h非光照的周期培养，每隔24 h更换一半水样，每个处理15孔，试验设3个重复。采用4种指标表征胚胎毒性：(1)胚胎孵化率，选择24、48、72 h孵化率指标；(2)胚胎死亡率，选择24、48、72 h死亡率指标；(3)幼鱼存活率，胚胎染毒96 h后统计存活数在孵化数中的比例，表征幼鱼期急性毒性；(4)幼鱼致畸率，胚胎染毒96 h后统计致畸数(不包括死亡幼鱼)在孵化数中的比例，致畸指标包括心包囊肿、卵黄囊肿、脊柱弯曲，由于本次试验心包囊肿出现频率高，以该指标作为致畸评价指标。

图1 采样点示意图Fig.1 The distribution of sampling sites

1.3 化学分析

地下水挥发性有机物测定参考文献[11]进行，半挥发性物质、耗氧量、氟化物、重金属等指标测定参考文献[12]进行。特征污染物氟虫腈、乙虫腈、氟节胺、克百威、炔螨特、丁硫克百威采用C18富集，液相色谱—三重四级杆质谱法进行分析。由于A04和B01水样被诊断为具备生物毒性，但化学分析未能明确污染物质，于是将A04和B01水样进行进一步定性检测，A04水样真空浓缩10倍，采用高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS)进行分析，B01水样用氢氧化钠调节pH至10，乙酸乙酯萃取两次，气相色谱—质谱分析。

表1 地下水化学分析结果

2 结 果

2.1 地下水化学分析

杭州地区对地下水没有明确分类，但在风险评估中一般要求执行《地下水质量标准》(GB/T 14848—2017)Ⅲ类标准，即地下水化学组分含量中等，适用于集中式生活饮用水水源及工农业用水。表1为地下水分析结果。6口井地下水pH均呈中性，pH为7.06～7.34。企业A不同点位耗氧量差异极大，范围为1.79～14.20 mg/L。A04(近制剂车间)和A02(近焚烧炉)的地下水耗氧量超过10 mg/L，超过GB/T 14848—2017 Ⅲ类标准, 超标倍数分别为3.06和3.73，由于A02在焚烧炉影响区域，估计这口井水质可能受焚烧炉作业影响；氟化物为0.60～1.83 mg/L，A01(近合成区域)超标；地下水中检出挥发性有机污染物1,2-二氯乙烷和氯苯，两种污染物均未超标。企业B生产区两口井B01、B02耗氧量分别为2.09、7.36 mg/L，B02耗氧量超标；氟化物分别为2.46、0.89 mg/L，B01氟化物超标；挥发性有机污染物1,2-二氯乙烷有检出，但未超标。企业A的特征污染物氟虫腈、乙虫腈，以及企业B的特征污染物氟节胺、克百威、炔螨特、丁硫克百威均未检出。因此从地下水化学分析结果判断，两个在产农药生产企业浅层地下水质量基本可控，但受工业生产影响，部分指标超标。

2.2 发光细菌急性毒性诊断

洗井24 h后采地下水分析，发现企业A地下水对发光细菌无毒；企业B两口井差异很大，B01发光细菌抑制率达48%，低毒；B02发光细菌抑制率低于4%，无毒(见图2)。上述现象说明企业B地下水存在一定量的毒性物质， B01综合毒性高于B02。鉴于两个农药生产企业均存在氟化物超标现象，本研究同时监测了水样中氟化物分别为1.00、2.00 mg/L时的发光细菌毒性，结果表明氟化物在2.00 mg/L以内无毒。

2.3 斑马鱼胚胎及幼鱼毒性分析

取A04、B01水样进行斑马鱼胚胎毒性分析，蒸馏水作为对照。在受精后不同时间段(24、48、72 h)观察斑马鱼的发育变化，统计各试验组斑马鱼胚胎的孵化数、死亡数和致畸数。

图2 地下水发光细菌急性毒性结果Fig.2 Acute toxicity of luminescent bacteria for groundwater

2.3.1 形态学观察

B01的24 h胚胎凝固率异常高，显然其对胚胎具有急性毒性，A04和对照未见明显毒害作用，说明A04对胚胎期和卵黄囊期的斑马鱼致死作用不明显。多数斑马鱼胚胎在A04中48 h已完成孵化，但在B01和对照中暴露72 h才完成孵化。96 h时观察胚胎孵化后的致畸数和死亡数，发现A04和B01中脊柱弯曲的幼鱼基本死亡，B01心包囊肿出现频率较高。

2.3.2 胚胎死亡率和孵化率

图3(a)为斑马鱼胚胎死亡率对比情况，对照、A04、B01处理的斑马鱼胚胎24 h死亡率分别为0、15.56%、82.00%，存在显著差异，且B01在24 h内胚胎凝固率异常高，说明B01对斑马鱼胚胎发育的早期阶段影响很大，具有较强的急性毒性。相比之下A04对胚胎期和卵黄囊期的斑马鱼致死作用较弱，与区域对照点的胚胎死亡率差异较小(图3中未列出，区域对照点24、48、72 h的胚胎死亡率分别为15.56%、15.56%、17.78%)。

图3(b)为斑马鱼胚胎孵化率对比情况，对照处理72 h孵化率为100.00%；B01的72 h孵化率仅为6.67%，A04的斑马鱼胚胎48 h就已孵化，48 h孵化率达75.56%，72 h孵化率为73.33%，即A04对斑马鱼胚胎具有十分显著的孵化促进作用，孵化后的幼鱼24 h存在死亡现象。

图3 地下水对斑马鱼胚胎死亡率和孵化率的影响Fig.3 Effects of groundwater on mortality and hatching rate of zebrafish embryos

2.3.3 幼鱼存活率和致畸率

对照、A04、B01处理的斑马鱼胚胎孵化数分别为15、11、1条(3组实验取平均值)；图4(a)为斑马鱼幼鱼存活率对比情况，对照和B01中存活率为100.00%，A04中存活率仅为30.68%。A04对斑马鱼胚胎有孵化促进作用，但对幼鱼具有毒性，而B01对斑马鱼早期胚胎致死率极高，但孵化后幼鱼存活率高。

图4(b)为斑马鱼幼鱼致畸率对比情况，对照中斑马鱼幼鱼未见致畸现象，A04中孵化的幼鱼致畸率为12.87%，B01则高达100.00%。

3 讨 论

从现场踏勘和信息反馈来看，企业A环境管理和污染控制水平优于企业B，企业A车间布局合理，合成车间和制剂车间底层均为包装等轻污染工序，企业B整体为钢架结构，反应釜就在底层。从化学分析角度，在产农药生产企业地下水污染较轻，

图4 地下水对斑马鱼幼鱼致畸率和存活率的影响Fig.4 Effects of groundwater on teratogenic and survival rate of juvenile zebrafish

毒性物质基本可控，两家企业地下水耗氧量和氟化物指标超标，企业A主要检出1,2-二氯乙烷、氯苯，企业B检出1,2-二氯乙烷。由于在产企业的部分采样点无法靠近生产区域，污染物质浓度较低或未检出并不能代表企业未受污染，对于在产企业来说，最主要的是确定有无泄漏，早发现，早提出对策，从而实现污染防控，因此从检测手段来说，应优先或同时选择几种灵敏度高的表征方法，但目前第三方检测机构基本依据行业标准对挥发性、半挥发性有机污染物进行检测，其方法更适用于退役场地高浓度污染物的检测，对于在产企业非重点生产区域低浓度污染物的检测存在局限性。

生态毒理学的风险综合诊断方法是化学诊断方法的有益补充。本研究采用发光细菌急性毒性试验和斑马鱼胚胎毒性试验检测了两个在产农药生产企业浅层地下水的生物毒性，结果表明两家企业地下水均存在一定的生态风险。企业B地下水发光细菌急性毒性呈低毒，但斑马鱼胚胎急性毒性非常强，24 h死亡率达82.00%，孵化出的幼鱼致畸率为100.00%。企业A地下水发光细菌急性毒性为无毒，明显促进斑马鱼胚胎的孵化，但孵化后幼鱼存活率低，仅为30.68%。上述结果表明斑马鱼胚胎毒性试验可能较发光细菌急性毒性试验更为灵敏，具有可记录多项毒性指标的特点[1]704,[13]1092，更适用于在产企业地下水污染诊断，但其试验周期相对较长，相较之下，发光细菌急性毒性试验更适用于批量试验，两者联合使用可以快速识别和筛选场地污染区域。

两家农药生产企业地理位置相邻，但生物毒性反应并不一致，说明地下水的生物毒性是农药生产企业特征污染物所致，并不是区域共性地下水污染物引起。本研究检测时发现A04水样中含一种除草剂环莠隆(C11H22N2O)，但企业否认有该物质，除草剂复配过程需使用表面活性剂，在采样过程也发现A04水样有气泡(表面活性剂存在的一种表现)。刘迎等[13]1091研究了6种常见农药表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应，发现6种表面活性剂均诱导斑马鱼出现身体侧翻、游囊关闭的现象。斑马鱼幼鱼需要游到水面，呼吸空气以后游囊才能张开[14]，GOOLISH等[15]认为游囊的正常膨大对于调控鱼体上浮下沉，提高取食效率非常重要。鉴于A04水样对幼鱼期斑马鱼开口摄食影响很大，初步判断该区地下水可能受农药表面活性剂的影响。B01水样检测到毒性物质2,4-二叔丁基酚，该物质对斑马鱼24 h的半数致死浓度(LC50)为1.866 mg/L，属于高毒物质[16]。

4 结 语

调查的两家在产农药生产企业浅层地下水存在生物毒性，企业A地下水发光细菌急性毒性为无毒，明显促进斑马鱼胚胎的孵化，但孵化后幼鱼存活率低，进一步的风险排查应主要关注环莠隆和表面活性剂。企业B地下水发光细菌急性毒性为低毒，但斑马鱼胚胎急性毒性非常强，建议关注2,4-二叔丁基酚。斑马鱼胚胎急性毒性和发光细菌急性毒性试验联合使用可以快速识别和筛选场地地下水污染区域。