lncRNA H19对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及其分子机制

胡鑫，刘剑仑，韦薇，钟国斌 广西医科大学第二附属医院，南宁530007； 广西医科大学附属肿瘤医院

乳腺癌是危害女性健康的最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有170万人发生乳腺癌，大约有50万人死于该病。虽然乳腺癌的诊断和治疗已经取得了一定进展，但是其发病率在发展中国家仍逐年升高[1]。因此，进一步探索乳腺癌发生发展的分子机制并寻找用于检测和治疗乳腺癌的新靶标至关重要。长链非编码RNA(lncRNA)是指长度超过200个核苷酸，不能编码蛋白质，但具有生物学功能的RNA分子。lncRNA近年已被证实与肿瘤的生物学行为密切相关，参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[2～4]。lncRNA H19是lncRNA的一种，长度为2.3 kb，位于染色体11p15.5[5]。研究报道，lncRNA H19在胃癌组织和细胞中的表达升高，能够通过增强NF-κB诱导的炎症反应促进胃癌细胞侵袭和转移[6]。2019年6月～2020年6月，本研究观察了lncRNA H19对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响，并探讨其机制是否与靶向miR-194-5p表达有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人乳腺癌细胞系(SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7)和正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A)均购自美国ATCC细胞库。主要试剂：培养基、胎牛血清(FBS)及二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Gibco公司，TRIzol、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司，CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所，基质胶Matrigel与Transwell小室购自美国Corning公司，LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。主要仪器：酶标仪、实时荧光定量PCR仪均购自美国Thermo公司。主要质粒：pcDNA-H19、H19 siRNA、miR-194-5p minic均由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.2 细胞lncRNA H19表达检测 采用实时荧光定量PCR法。选择生长状态良好的SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7及MCF-10A细胞，采用TRIzol法提取总RNA，根据制造商说明书使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。lncRNA H19上游引物5′ -GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3′，下游引物5′ -GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3′；内参GAPDH上游引物5′ -AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。根据SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明，PCR反应体系20 μL，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA H19相对表达量。

1.3 细胞分组转染及转染效率检测 将SKBR3细胞以2×105/孔接种于6孔板，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中进行培养，培养基为含10% FBS的DMEM 高糖培养基。当细胞融合度达75%左右时，收集对数生长期的SKBR3细胞。将SKBR3细胞分为三组，pcDNA-H19组和si-H19组分别采用LipofectamineTM2000转染试剂说明书转染pcDNA-H19、H19 siRNA，空白对照组不进行转染。转染48 h后收集三组细胞，参照1.2采用实时荧光定量PCR法检测lncRNA H19表达。

1.4 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。三组细胞以3×103/孔接种于96孔板，将含10% FBS的培养基加入孔板，使每孔液体量达到100 μL，每组设立6个复孔。培养0、24、48、72、96 h，三组分别设置3个复孔，每孔加入10 μL CCK-8试剂；37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 h，然后使用酶标仪系统检测各孔450 nm处光密度(OD)值。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。用无血清培养基以1∶4的比例稀释Matrigel，以50 μL/孔包被Transwell小室，将小室放入24孔板中，置于37 ℃培养箱中孵育1 h。常规消化三组细胞后用无血清培养基调整细胞密度为2×105/mL，向小室内分别加入三组细胞悬液200 μL，小室下层加入含10 % FBS的完全培养基500 μL。37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，取出小室，用无菌棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定下层细胞；1%吉姆萨染色，PBS冲洗3次，干燥后在倒置显微镜下对小室下层细胞拍照，随机选取5个视野，对穿膜细胞计数后取平均值。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。取三组细胞进行常规消化，以3×105/孔接种于6孔板。当细胞基本长满时，使用20 μL小枪头垂直背面的直线在6孔板中间划线。PBS洗涤3次，洗去划下的细胞，加入2 mL含10%FBS的培养基并拍照(此时记为0 h)。24 h后在相同位置拍照，使用Image J软件计算三组细胞在0 h与24 h的距离，并计算划痕愈合率。实验重复3次，取平均值。

1.7 lncRNA H19对miR-194-5p的调控作用观察 ①采用双荧光素酶报告实验。Starbase2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)软件预测程序显示，lncRNA H19和miR-194-5p之间存在连续的结合位点，见图1。用PCR法扩增lncRNA H19上两者的结合片段，并将该片段插入到pMIR-REPORT中，构建lncRNA H19野生质粒(H19-wt)，再应用基因突变技术将结合位点突变，获得lncRNA H19突变质粒(H19-mut)。将SKBR3细胞接种至24孔板中，参照LipofectamineTM2000说明书，将细胞分为四部分，分别进行H19-wt、H19-mut与miR-194-5p mimic、NC mimic共转染。转染24 h后，检测荧光素酶活性，实验重复3次。②采用实时荧光定量PCR法。取1.3中的三组细胞，参照1.2采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-194-5p表达，miR-194-5p上游引物5′-GCCGCTGTAACAGCAACTCCAT-3′、下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

图1 Starbase2.0软件预测程序显示lncRNA H19和miR-194-5p之间存在连续的结合位点

2 结果

2.1 乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞lncRNA H19表达比较 乳腺癌细胞系SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7中lncRNA H19相对表达量分别为8.37±1.21、5.62±0.85、3.43±0.96，均高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中的1.08±0.24(P均<0.01)。其中，SKBR3细胞lncRNA H19相对表达量升高最显著，故选用SKBR3细胞用于后续实验。

2.2 三组lncRNA H19表达比较 si-H19组、空白对照组、pcDNA-H19组中lncRNA H19相对表达量分别为0.28±0.08、1.08±0.10、3.04±0.32，三组lncRNA H19相对表达量依次升高(P均<0.01)。

2.3 三组细胞增殖能力比较 培养24、48、72、96 h，si-H19组、空白对照组、pcDNA-H19组相同时间点OD值均依次升高(P均<0.01)。见图2。

图2 三组细胞增殖曲线

2.4 三组细胞侵袭、迁移能力比较 si-H19组、空白对照组、pcDNA-H19组穿膜细胞数分别为(31±2)、(65±3)、(102±5)个，划痕愈合率分别为15.35%±0.88%、31.74%±2.27%、52.18%±2.89%，三组均依次升高(P均<0.01)。

2.5 SKBR3细胞中lncRNA H19与miR-194-5p的相互作用结果 ①双荧光素酶报告试验结果:共转染miR-194-5p mimic+H19-wt或NC mimic+H19-wt的SKBR3细胞荧光素酶活性分别为0.33±0.02、0.97±0.06(P<0.01)，共转染miR-194-5p mimic+H19-mut或NC mimic+H19-mut的SKBR3细胞荧光素酶活性分别为1.02±0.04、1.06±0.05(P>0.05)；提示lncRNA H19和miR-194-5p之间存在靶向调控关系。②实时荧光定量PCR结果:si-H19组、空白对照组、pcDNA-H19组miR-194-5p相对表达量分别为3.26±0.21、0.98±0.10、0.34±0.06，三组均依次降低(P均<0.01)。

3 讨论

人类基因组中70%～90%的基因序列可转录为RNA，但是具有编码蛋白质功能的RNA只有2%，这些不具有编码蛋白质功能的RNA称为非编码RNA(ncRNA)[7]。lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，可通过多种表观遗传机制调控基因的表达，对机体产生重要的生物学作用，并与肿瘤发生发展过程密切相关。Qiu等[8]研究发现，lncRNA PVT1能够通过靶向miRNA-526b/EZH2调控环加速非小细胞肺癌的进展。Li等[9]通过体内、外实验证实，lncRNA FTX可以促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及肿瘤生长，这种作用可以被miR-144抑制。另有文献报道，在胶质母细胞瘤细胞中过表达lncRNA MATN1-AS1可显著抑制肿瘤生长[10]。

lncRNA H19是lncRNA中的一员，参与哺乳动物早期胚胎发育，其表达量在组织器官成熟后逐渐下调。近年来研究发现，lncRNA H19表达在多种恶性肿瘤组织中重新上调，对于肿瘤的进展、转移发挥重要作用。Gao等[11]报道，lncRNA H19在肺腺癌组织中呈高表达，可通过介导肺腺癌细胞上皮间充质转化促进肿瘤组织的体内外生长。在食管癌中，lncRNA H19在癌组织中表达上调，并通过STAT3/EZH2通路促进食管癌细胞增殖和转移，同时高表达的lncRNA H19与食管癌患者预后不良密切相关[12]。lncRNA H19还可通过抑制E-cadherin表达而促进膀胱癌细胞转移，其表达与膀胱癌患者的临床分期显著相关[13]。上述结果均表明，lncRNA H19能够发挥原癌基因作用，但其对乳腺癌细胞生物学功能的影响尚不明确。本研究结果显示，lncRNA H19在乳腺癌细胞系中的表达明显升高，提示lncRNA H19可能参与乳腺癌的发生。为进一步明确lncRNA H19对乳腺癌细胞生物学功能的影响，本课题组在SKBR3细胞中干扰lncRNA H19表达，发现细胞增殖、侵袭及迁移能力均减弱；而过表达lncRNA H19后，细胞增殖、侵袭及迁移能力均增强。这表明作为致癌lncRNA的lncRNA H19在乳腺癌的发生和发展中具有重要作用。

研究认为，lncRNA-miRNA功能网络在乳腺癌的发生进展过程中发挥重要作用[14]。目前，关于lncRNA H19的靶基因及其对乳腺癌致癌的分子机制尚不清楚。本课题组通过Starbase2.0预测程序发现lncRNA H19和miR-194-5p之间存在连续的结合位点。miR-194-5p被认为是一类抑癌基因，可通过增强卵巢癌细胞对紫杉醇化疗药物的敏感性而延缓卵巢癌进展[15]。本研究发现，lncRNA H19过表达能明显抑制SKBR3细胞miR-194-5p表达，沉默lncRNA H19后miR-194-5p表达升高，提示lncRNA H19可负靶向调控miR-194-5p表达，荧光素酶报告实验进一步验证了lncRNA H19与miR-194-5p的靶向调控关系。

综上所述，乳腺癌细胞lncRNA H19表达升高，lncRNA H19可能通过负靶向调控miR-194-5p而促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。