手足口病毒诱导肠上皮细胞差异表达miRNA的筛选及其在患儿粪便标本中的诊断效能分析

熊英，唐晓磊，朱芮 武汉大学中南医院，武汉43007；皖南医学院第二附属医院

手足口病以粪口途径传播为主，是一种在婴幼儿群体中广泛流行的病毒性疾病[1]，肠病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)是导致其发生的主要流行病原体[2,3]。这两种病原体主要诱发以发热、疱疹为表现的临床症状，但是CA16感染主要引发持续性的、较为缓和的发热症状，而EV71通常会导致较为严重的、中枢神经系统症状[4～6]。目前，针对手足口病不同亚型病毒的检测有血清IgM法、核酸PCR法及病毒分离培养法，对实验条件的要求较高，且与标本采集质量关系密切。miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的单链非编码RNA，对多项细胞生理功能发挥多重调控作用[7]。病原体可影响宿主miRNA表达，而宿主表达变化miRNA也能作为检测某种病毒感染的特异性标志物[8,9]。2017年1月～2019年1月，本研究观察了EV71及CA16对人肠上皮细胞系(HIEC)miRNA表达的影响，并以此筛选出具有相对普遍性的miRNA作为诊断标志物，分析其联合检测在手足口病患儿粪便标本中的诊断效能。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 ①病毒：EV71(EV71-C4亚型，GenBank: EU812515.1)、CA16(CA16-G20亚型，GenBank: JN590244.1)均由武汉大学病毒研究所分离保存。②细胞：HIEC购于武汉大学细胞菌种典藏中心。③主要试剂：青-链霉素双抗购于北京索莱宝生物技术有限公司，miRNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购于美国Thermo Fisher公司，miRNA微阵列芯片购于北京博奥芯片生物技术有限公司；EV71型IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒、CA16型IgM抗体胶体金法检测试剂盒购于北京万泰生物药业有限公司，EV71/CA16双重荧光RT-PCR检测试剂盒购于广州健仑生物技术有限公司；粪便RNA提取试剂盒购于宁波重鼎生物技术有限公司。④临床分离病毒株：收集来自3个不同地域(安徽阜阳、湖北武汉和广东广州)的临床手足病患儿分离的病毒株共46株，其中EV71 35株、CA16 6株、CA其他亚型5株。

1.2 手足口病毒诱导HIEC差异表达miRNA筛选

1.2.1 EV71、CA16感染 将扩增得来的EV71、CA16分别悬于无菌生理盐水中，均匀分散，测得260 nm处光密度值，以此计算病毒数量，加入DMEM完全培养基重悬后备用。取对数生长期的HIEC，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2×106/mL，置于细胞培养箱中培养48 h；随后换液，保留贴壁细胞，按照病毒∶细胞为10∶1的比例分别加入EV71、CA16。

1.2.2 EV71、CA16感染后差异性表达miRNA筛选 采用miRNA微阵列芯片分析。两种病毒感染0、24、48、96 h时分别收集细胞，提取总RNA备用。取RNA 100 ng，用Cy标记，变性后在微阵列芯片上杂交，芯片上含有捕获miRNA的探针；通过芯片晶芯luxScan10K微阵列芯片扫描仪读取荧光成像，并采用软件量化杂交信号;以U6为内参，在Sanger miRBase数据库中列出差异表达的miRNA，并计算相对于感染0 h的表达变化倍数。以P<0.05且相对变化倍数>2定义为有意义的miRNA。

1.2.3 具有相对普遍性的差异表达miRNA筛选 采用实时荧光定量PCR法。将HIEC分为观察组和对照组，观察组参照1.2.1的方法培养及感染临床手足口病患儿分离病毒株46株，对照组不感染病毒株。培养72 h提取两组细胞的总RNA，使用TaqMan miRNA逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录。6个差异表达miRNA及内参U6引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.3 差异性表达miRNA在手足口病患儿粪便标本中的诊断效能分析

1.3.1 临床资料 选择武汉大学中南医院2017年5～9月收治的手足口病患儿40例，男23例、女17例，年龄(39.8±16.3)个月；患儿就诊时间均为出现症状(发热、厌食、疱疹)当天，手足口病诊断标准参照卫计委颁布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》。选择同期与患儿性别、年龄匹配的健康体检儿童52例作为对照。本研究通过医院伦理委员会审核，受试者监护人均签署知情同意书。

表1 6个差异表达有意义的miRNA及内参U6引物序列

1.3.2 诊断方法 ①粪便miRNA联合检测法：收集患儿和健康儿童随机粪便0.15 g，采用粪便RNA提取试剂盒提取总RNA，实时荧光定量PCR法检测4个升高幅度较大的miRNA相对表达量，操作方法参照1.2.3。以上4个miRNA中任意3个或4个miRNA升高定义为阳性。②血清IgM抗体检测法：收集患儿和健康儿童全血2 mL，待血液凝固后，3 000 r/min离心15 min，取上层血清。严格按照EV71型IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒及CA16型IgM抗体胶体金法检测试剂盒说明书进行操作，并根据说明书判读阴性或阳性。③咽拭子病毒核酸检测法：收集患儿和健康儿童咽拭子，在无核酸酶管中加入1 mL裂解液，充分混匀，严格按照说明书操作。将提取获得的RNA用25 μL无RNA酶的去离子水溶解，并进行实时荧光定量PCR检测。待测模板初始拷贝量的负对数与检测Ct值线性分析由实时荧光PCR仪自动生成。

2 结果

2.1 EV71、CA16感染HIEC后的miRNA表达变化 miRNA微阵列芯片检测了164个miRNA，只有少数几个miRNA表达降低且相对降低倍数<2，大多数miRNA表达上调，其中表达上调有意义的前6个miRNA是miR-526a、miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p、miR-5585-3p和miR-146a。见表2。

表2 EV71、CA16感染HIEC后表达上调有意义的前6个miRNA相对表达量变化

2.2 两组6个miRNA相对表达量比较 观察组miR-526a、miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p、miR-5585-3p和miR-146a相对表达量均明显高于对照组(P均<0.01)，见表3。选择4个升高幅度较大的miRNA(miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p、miR-5585-3p)作为后续粪便miRNA联合检测的靶标。

表3 两组6个miRNA相对表达量比较

2.3 3种检测方法对手足口病的诊断效能比较 3种检测方法的检出结果见表3，诊断手足口病的ROC曲线见图1。粪便miRNA联合检测法对手足口病的阳性检出率为87.50% (35/40)、灵敏度为90.91%、特异度为84.09%、准确性为92.30%、阳性预期值为94.59%、阴性预期值为90.90%，血清IgM抗体检测法对手足口病的阳性检出率为37.50%(15/40)、灵敏度为63.64%、特异度为85.71%、准确性为70.60%、阳性预期值为88.23%、阴性预期值为66.67%,咽拭子病毒核酸检测法对手足口病的阳性检出率为90.00%(36/40)、灵敏度为88.64%、特异度为92.86%、准确性为95.65%、阳性预期值为100%、阴性预期值为92.85%。

表3 手足口病患儿与健康儿童3种检测方法的检出结果

图1 3种方法诊断手足口病的ROC曲线

3 讨论

目前，对手足口病病原体EV71的疫苗已经应用于临床，并能够有效针对EV71发挥作用，但对其他亚型病毒的作用有限[6]。鉴于手足口病的传播途径，本次研究使用miRNA芯片分析了EV71和CA16诱导HIEC的164个miRNA表达变化，结果显示HIEC感染病毒株后多数 miRNA表达为上升趋势，仅少数为降低趋势；本研究仅将上升趋势较为显著的6个miRNA列出，且以不同区域的46株临床分离株分别感染HIEC，结果显示miR-5585-3p、miR-23b、miR-619-5p和miR-204-5p表达仍处于高水平，提示这4个miRNA的持续高表达可能参与了手足口病病毒感染宿主细胞的过程。

研究显示，miR-5585-3p在弥散型淋巴瘤中高表达，且与患者预后密切相关[11]。而本次研究报道发现，其在感染手足口病毒的HIEC中表达水平较高，在手足口病患儿的粪便中表达也较高。miR-23b是一种Notch2受体相关miRNA，已有关于miR-23b与胃癌发生相关的报道[12]。本研究中感染手足口病毒的HIEC中miR-23b表达升高，提示EV71、CA16病毒在侵袭过程中可能启动了Notch通路，有待进一步证实。miR-619-5p与肠道的相关研究表明，其通过影响转录因子MALAT1而对结肠肿瘤患者的预后有影响[13]。本次研究HIEC在手足口病毒感染后也表达出较高水平miR-619-5p，提示miR-619-5p对肠道病变有一定的指示作用，且手足口病病毒对肠道的损伤机制可能与MALAT1有一定的相关性。国内有研究报道，miR-204-5p与直肠癌肠上皮细胞的恶化以及肠易激综合征关系密切[14,15]。研究发现，在肠易激综合征患者中miR-204-5p与类胰蛋白酶表达有关，这可能与手足口病患儿的腹泻症状有关[15]。

本研究以筛选获得的4个高表达miRNA进行粪便miRNA联合检测，并与其他检测方法进行了对比。结果显示，粪便miRNA联合检测法的阳性检出率远高于血清IgM抗体检测法，可能与IgM的检测方法学以及机体免疫力、标本留取的阶段有关[16]。咽拭子病毒核酸检测法已成为目前临床最常见的手足口病检测手段，现有双重荧光及三重荧光等商品化检测试剂盒。本研究发现，咽拭子病毒核酸检测法对健康儿童的检测性能优于手足口病患儿。本研究同一批次的检测中发现2例健康儿童同时被粪便miRNA联合检测法和血清IgM抗体检测法检测为阳性，但咽拭子病毒核酸检测法却为阴性。因该2例儿童无任何明显的临床症状且粪便及咽拭子病毒核酸检测法重复检测均为阴性，考虑这2例儿童可能处于潜伏感染期，且为一过性感染，因此无明显的临床症状；而复检的时候无病毒存在，故粪便及咽拭子病毒核酸检测法重复检测均为阴性。

综上所述，EV71和CA16诱导HIEC表达明显升高的miRNA分别为miR-5585-3p、miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p，以其作为靶标进行粪便miRNA联合检测对手足口病的诊断效能高于血清IgM抗体检测法和咽拭子病毒核酸检测法。