基于近红外二区荧光纳米探针的活体光学成像技术在生物医学应用的研究进展

陈 蓦，陈 俊，陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学科，上海200040

光学成像技术具有灵敏度高、非侵入性和实时成像等优点，符合当下生物医学领域对于非侵入成像诊断技术的要求，被越来越多地应用于肿瘤组织、血管结构以及其他组织或部位的成像。随着临床医学和生物研究对成像精度和质量要求的不断提高，在传统的可见光成像的基础上，近红外（near-infrared，NIR）成像技术也日益受到基础科研工作者和临床医师的关注。NIR波段介于可见光和中红外之间，波长在650～2 500 nm[1-4]，而根据波长被细分为不同的光学窗口。例如，研究较早、较为经典的NIR光学成像窗口NIR一区[4]（first near-infrared，NIR-Ⅰ）在650～950 nm波长范围内，近年来光学活体成像领域研究中令人瞩目的NIR二区[5]（second near-infrared，NIR-Ⅱ）在波长1 000～1 700 nm范围内。NIR活体成像具有众多优点：与临床常用的X射线、核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）和超声等成像方法相比，NIR等光学成像的最大优点是空间分辨率高[6]；与可见光成像方法相比，NIR活体成像具有自体生物荧光背景低，生物体内血液和组织对光吸收少、散射少，组织穿透度深，成像速度快，图像对比度（或灵敏度）高，不良反应小以及对水、脂类、胶原蛋白的区分比较敏感等诸多优点[2,7-8]。而由于具有更长的波长，且光的散射强度随波长的增长成指数下降，使得NIR-Ⅱ与经典的NIR-Ⅰ活体成像相比，光子散射和吸收更少，自体生物荧光背景更低，具有更深的穿透性、更高的时空分辨率和信噪比[9]。NIR-Ⅱ又可划分为NIR-Ⅱ a（1 000～1 400 nm）和NIR-Ⅱ b（1 500～1 700 nm）[10]。目前NIR-Ⅱ的研究大多集中在NIR-Ⅱ a，而已知的NIR-Ⅱ b荧光纳米探针尚不多，因此本文主要探讨波长位于NIR-Ⅱ a的荧光纳米探针。

虽然NIR-Ⅱ活体成像具有诸多优势，但目前其应用仍受限于荧光纳米探针的发展跟不上成像设备和成像技术的发展需求。NIR-Ⅱ所用的荧光纳米探针与NIR-Ⅰ常用的荧光染料（如美国食品药品监督管理局批准的吲哚菁绿和亚甲蓝）有所不同，只有少数材料可以发射NIR-Ⅱ的波长。这些材料中一大部分是纳米材料，因其具有纳米级（0.1～100 nm）尺寸，使其在光学、热学、电学、磁学以及化学方面的性质与非纳米材料存在显著差别，并在NIR-Ⅱ成像方面具有一定优势。NIR-Ⅱ荧光纳米探针根据制备材料可分为无机荧光纳米探针和有机荧光纳米探针，前者主要包括量子点（quantum dot，QD）、稀土纳米粒子（rare earth nanoparticle，RENP）、单壁碳纳米管（single-wallcarbon nanotube，SWCNT），后者以共轭聚合物为主[5]。本文就这些荧光纳米探针的优点及局限性介绍其在NIR-Ⅱ活体成像应用中的相关进展，并对其未来的发展进行展望。

1 QD

QD作为一种半导体荧光纳米探针，具有良好的光学和化学稳定性，发射波长窄且可调谐，双光子吸收截面较高，具多色性等荧光成像特点，而其能够交联分子的特点更使其具有可以载药或携带其他靶向分子的潜质。QD最早于20世纪70年代被成功制备。Bruchez等[11]将QD作为荧光纳米探针应用于生物染色和诊断，实现了将其作为特异性生物标记的目标，为QD在生物医学领域的研究树立了里程碑。

第1代QD主要以镉化物[硫化镉（CdS）和硒化镉（CdSe） ]、铅化物[硫化铅（PbS）和硒化铅（PbSe） ]为主，制备方法成熟，产量高。由于铅和镉作为重金属具有已经明确的生物毒性，第1代QD在活体成像方面的应用受到限制。第2代QD为解决这一问题主要采用了2种改进方式。

第1种是在第1代QD表面包被其他物质外壳。Kong等[12]利用微波加热法合成了一种核糖核酸酶包被的PbS QD（RNase-A@PbS QD）。与之前报道的红外染料IR26的量子产率（0.11%）[13]相比，RNase-A@PbS QD的量子产率（17.3%）证实其是可用于活体成像方面最亮的水溶性NIR-Ⅱ发射体之一。更重要的是，体外实验表明这种RNase-A@PbS QD对胎鼠大脑皮质神经元细胞、人胃上皮正常细胞GES-1和人恶性黑色素瘤细胞A375均无毒性，还可通过网状内皮系统将体内静脉注射的QD在几日内完全代谢，从而将体内可能释放的铅的潜在长期毒性降到最低。

第2种是更换低毒性材料制备QD，如毒性较低的硫化银（Ag2S）QD[14]、磷化铟-硫化锌（InP/ZnS）QD[15]、铜铟硫-硫化锌（CuInS/ZnS）QD[16]、银铟硒-硒化锌（AgInSe2-ZnSe）QD[17]等。Allocca等[18]为对比InP QD和CdSe QD的毒性，利用水螅进行生物体内实验。实验发现InP QD的毒性较CdSe QD低，且这种毒性在体内可逆，类似于相同剂量的无毒纳米材料（如碳纳米管和二氧化硅纳米粒子）在水螅中测试的报道结果。虽然在动物模型中改良后的QD与含镉QD比较似乎相对安全，但并不能因此完全打消该QD对人体是否具有毒性的疑虑。Chen等[15]采用激光扫描共聚焦显微镜观察InP/ZnS QD标记的人肺癌细胞HCC-15和肺泡Ⅱ型上皮细胞RLE-6TN，发现InP/ZnS QD可进入细胞，且促进细胞凋亡与细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。因此，InP/ZnS QD仍存在一定生物毒性，未来如应用于活体成像或治疗给药还需优化表面修饰，进一步降低其生物毒性。

虽然目前的制备方法和表面功能修饰方式已降低了这些NIR-Ⅱ QD的生物毒性，但其安全性还存在争议，这可能会成为其应用于临床的潜在危险因素。

2 RENP

稀土是化学周期表中钪、钇和镧系元素共17种金属元素的总称。掺杂稀土元素的纳米粒子具有独特的光学、电学、磁学特性。镧系元素具有低光子吸收的特性[7]，以镧系化合物为代表的RENP的阶梯状能级具有窄的发射宽度，使得多光谱成像具有最小的光谱重叠。除此之外，RENP还具有尺寸高度可控、无光漂白现象、保存时间长、生物相容性好、发射波长较长等优点[19-20]。

RENP已应用于小肿瘤、血管以及骨的NIR-Ⅱ成像研究。Li等[21]用聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）对以四氟镥钠作基质、钆作敏化剂、钕作激活剂的棒状纳米粒子（NaLuF:Gd/Nd纳米棒）进行改性，以便用于高灵敏度的活体成像和光学成像引导下的小肿瘤检测；以钆作为主要合成元素，通过掺杂钕元素进行调整，以便将发射波长集中在1 056～1 328 nm，获得较高的光稳定性；动物实验证实了其在NIR-Ⅱ对小肿瘤（5 mm）诊断的可行性和对小血管成像具有高空间分辨率（约105 μm）；组织学实验表明，这种纳米棒具有亲水性和良好的生物相容性，对活体动物的毒性作用微乎其微。

与大多数荧光纳米探针应用于血管成像不同，He等[22]制备了一种由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇包被并掺有稀土的纳米粒子 （RENPs@DSPE-mPEG），该纳米粒子因在不连接任何靶向配体的情况下对骨骼固有亲和力，而有望成为骨骼系统成像的荧光纳米探针；除骨显像之外，RENPs@DSPE-mPEG也可在血管和淋巴结中显像；有趣的是，与大多数纳米材料在生物体内通过肝脏等器官代谢不同，RENPs@DSPE-mPEG可以通过循环白细胞内化。这一发现为RENP在肿瘤的免疫治疗等领域的应用提供了可能。

3 SWCNT

SWCNT由单层石墨烯卷曲而成，直径在1～150 nm，长度可达厘米级。自1991年日本电镜学家Iijima[23]在Nature杂志上首次发表了在用直流电弧放电法制备 C60的过程中发现碳纳米管的报道之后，碳纳米管便迅速在物理、化学和工业等诸多领域广泛研究应用。直到2002年，O′Connell等[24]发现SWCNT能 在NIR波段发射荧光并在Science杂志上发表该研究成果，SWCNT在NIR光学成像方面的应用才为大家所知晓。SWCNT是一种近似理想的生物探针，在NIR-Ⅱ具有很强的荧光，几乎不具有任何毒性，且几乎无光漂白现象。

Takeuchi等[25]制备了一种涂有磷脂-聚乙二醇并掺杂氧元素的SWCNT（o-SWCNT-PEG），这种SWCNT通过980 nm激发光在约1 300 nm处发出荧光；通过静脉注射的o-SWCNT-PEG可在小鼠血管内循环3 h，在1 d内清除；小鼠肝脏和脾脏的SWCNT荧光信号持续了1个月，2个月后小鼠未见明显体质量或外观异常，提示o-SWCNT-PEG的毒性较低。因此，o-SWCNT-PEG具有在NIR-Ⅱ波长范围内成为血管成像探针的潜质。

虽然SWCNT被认为是NIR-Ⅱ成像的理想候选材料，但其水溶性和生物相容性较差。现可通过共价或非共价表面修饰的方法来解决这一问题。共价修饰会打破共轭π键连接，降低荧光产量和活体成像的清晰度。相比之下，非共价表面修饰可以保留由sp2石墨化碳原子组成的初始结构，并保持预期的NIR-Ⅱ波段的荧光发射[20]。因此，非共价表面修饰可作为表面修饰的首选方法。值得注意的是，SWCNT的低荧光量子产量一直是其发展的一个瓶颈，有文献[26]显示，SWCNT的荧光量子产率仅约为0.4%。

4 共轭聚合物

共轭聚合物是由3个及以上互相平行的p轨道形成大π键的共轭化合物聚合而成的。共轭聚合物具有高摩尔消光系数、宽发射波长、较强的光捕获能力，可放大荧光传感信号，并且易于制备。但它受激发波长和发射波长的限制[26]，且大部分共轭聚合物的水溶性较差。

具有供体-受体结构的低能隙共轭聚合物已作为NIR荧光纳米探针应用于活体成像。Zhang等[27]为控制分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT）以保持低能带隙，提高NIR-Ⅱ荧光强度，开发了一种水溶性醌型聚合物。这种聚合物通过增加噻吩链长度，降低吸电子基团的密度，使ICT减少，NIR-Ⅱ荧光变强。该醌型聚合物探针可用于体内细胞示踪、血管系统成像、淋巴引流成像等多种生物医学成像，且具有良好的长期稳定性和较高的体内空间分辨率。

值得一提的是，共轭聚合物在光声成像方面具有良好的前景。虽然QD、SWCNT等荧光纳米探针也在光声成像的研究中有所应用，但共轭聚合物在光声成像方面的研究应用相比前两者更多。共轭聚合物能利用光声效应将吸收的光子经热弹性膨胀转化为声波[28]，从而结合光学和声学成像各自的优势，减少光散射和组织吸收，增强成像分辨率。共轭聚合物尤其对深部组织的成像具有优势，可实现更加清晰、直观、立体的成像目标。

Jiang等[29]报道了一个可用于NIR-Ⅱ光声成像的共轭聚合物纳米粒子，其可作为光声发射器，在1 064 nm处发出高强度的光声信号，透过小鼠的完整颅骨对皮下肿瘤和深部脑血管系统进行清晰的NIR-Ⅱ光声成像。这种共轭聚合物纳米粒子能被吞噬细胞中的髓过氧化物酶和脂肪酶降解，由非荧光纳米粒子（30 nm）转化为NIR荧光超细代谢物（约1 nm）。更重要的是，小鼠实验表明其能被肝脏和肾脏完全代谢清除，无毒性。该类报道增加了对于共轭聚合物光声成像未来早日应用于临床的信心。

5 展望

综上所述，上述NIR-Ⅱ活体成像常用荧光纳米探针均有各自的优缺点，因而针对不同的生物医学需要，需要选择更加符合客观要求的NIR-Ⅱ荧光纳米探针。相比较而言，目前用于NIR-Ⅱ活体成像研究的荧光纳米探针主要集中在QD，尤其是硫化铅或者硫化银QD。因为大量文献报道通过表面修饰和/或更换低毒性元素等方法能使QD的潜在生物毒性有所降低，所以可以相信NIR-Ⅱ荧光QD在今后的NIR-Ⅱ活体成像领域仍会处于主体地位。RENP的研究紧随其后，也会在接下来的研究领域占有一席之地。SWCNT在NIR成像领域的应用起步较晚，目前研究也较少，且受到低生物相容性和低荧光量子产率的限制；若不能解决这些问题，其今后的临床应用仍困难重重。共轭聚合物因在光声成像方面具有的优良特性，近年来逐渐受到关注，可能在今后的 NIR-Ⅱ活体多模态成像领域有更广阔的前景。随着这些NIR-Ⅱ荧光纳米探针的不断发展，NIR-Ⅱ活体成像技术（包括造影剂和活体成像仪器平台）也将逐步突破目前的瓶颈，为后续临床应用奠定良好基础，并有可能成为临床影像诊断中的一种重要技术手段。