循环肿瘤细胞在肿瘤精准医学中的应用浅析

邹畅，赵盼，胡凤艳

（深圳市人民医院临床医学研究中心 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院，广东 深圳518020）

恶性肿瘤已成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题,国家癌症中心最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91%，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势。 肿瘤精准医学是一种基于肿瘤病人“定制”的医疗模式，即“对症下药”,根据每个肿瘤患者个体特征而定制和实施个性化治疗方案。 癌症精准医学诊断检查不仅限于基因和蛋白检测, 包括遗传、分子及细胞学信息、生活方式、环境信息达到在内的大数据综合分析，旨在实现精确诊断[1]。 无创诊疗是肿瘤精准医学发展的重要方向,目前临床应用较多的主要是基于循环肿瘤细胞（Circulation tumor cell，CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA）的精准诊疗检测产品[1]。 CTC 是指来源于原发肿瘤或转移灶中能脱离基底膜并能通过组织基质入侵到外周血中的肿瘤细胞[1,2], CTC 可动态反应肿瘤的疾病进展,为肿瘤的早期诊断、预后评估、疗效监测、复发转移检测、实时动态监测和个体化诊疗等，为肿瘤诊疗提供了一种简便快捷的手段[1]。

1 循环肿瘤细胞的生物特性

CTCs 自身存在某些物理特性。第一，数量的稀有性[3]：CTCs 在外周血液中的含量极低，每毫升人外周血中检测到的CTC 不到1 个, 而外周血液循坏中的红、白、血小板等成分的数量级又十分巨大[4]。 第二，形态的非典型性[3]：CTCs 从原发部位或者转移灶脱落进入血液循环后,随着血液循环的快速流动,并在流动过程中受到血管壁的物理挤压和机体免疫系统以及药物的化学攻击等作用, 导致CTCs 的大小,形态,以及表型等发生未知的改变。第三，CTCs 的异质性[3]：肿瘤在发生和转移过程中会出现时间和空间上的异质性, 在这过程中CTCs 发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）,CTCs 表型动态变化。第四,具有更大的核质比，细胞核的形态各异[5]。 细胞形态的改变是机械性能改变的基础,并为CTCs 提供多种功能。这种柔韧性可以促进它们从原发性肿瘤侵入远端部位,并且可以赋予它们抵抗在转移过程中受到血管内流体剪切应力损害的能力[6]。 也影响了它们的表面电荷和电性能。 以上特性使得CTCs 的微量捕获和高灵敏的检测成为后续分析的重要前提。

2 循环肿瘤细胞的富集、检测和分析方法

2.1 CTCs 的分离富集技术 ⑴基于CTCs 和正常血液细胞在大小、 形态等方面存在差异特征分离CTCs。 通过设计一定滤过孔径的聚碳酸酯膜，依据肿瘤细胞比正常血细胞直径大的原理分离CTCs称为ISET(Isolation by size of epithelial tumor cells)方法[7]。 通过此物理特征分离出的CTCs 形态完整，细胞表面表达的抗原未遭破坏,为后续进行免疫标记、染色等鉴定提供了可行性和准确性。 但外周血中的也存在着许多大体积细胞，又有部分CTCs 体积较血细胞相似甚至更小,从而降低了该分离方法的灵敏度和特异度。 ⑵基于CTCs 与其他血细胞表面抗原的差异以分离检测CTCs。由于大部分CTCs表达细胞角蛋白（CK）,上皮细胞黏附分子(EpCAM)等上皮细胞标记, 通过靶向肿瘤细胞特异性抗原（CK、EpCAM） 的正向富集和靶向白细胞表面抗原标志物（CD45）的反向分离来进行免疫识别[8]。在免疫识别的基础上结合特殊材料如：纳米芯片，微流控，免疫磁珠等以实现CTCs 的有效分离[9]。 这类方法富集到的CTCs 特异性强，纯度高。 但由于CTCs会发生EMT,使得利用上皮标志物的正向富集会遗漏具有转移能力的那部分CTCs。因此，在现有的基础上发展出更高效的, 特异性更强的通用的CTCs的肿瘤标记是一大要克服的难题。

2.2 CTCs 的识别鉴定技术 CTCs 的鉴定通常采用免疫细胞化学法（ICC），基于核酸的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），流式细胞术（FCM），荧光原位杂交（FISH），CanPatrol CTC 分型检测技术等[8]。其中ICC 是将待检测的细胞固定后,依据抗原抗体特异结合的基本原理,与荧光标记的细胞上皮性特异性抗原如EpCAM、CK 等的抗体进行结合。同时，在体系里加抗白细胞抗体来排除假阳性。 RT-PCR是从RNA 水平上进行的检测,因CTCs 表达特异性的mRNA，而正常血细胞中不表达的差异来进行鉴定。 但该检测方法需要破坏细胞的形态且敏感性偏低[10]。 FCM 是借助单克隆抗体和荧光染料结合CTCs 进行染色,而后对染色的CTCs 进行定量分析的技术。 可同时使用多种染料对靶细胞进行标记来提高特异性[11]。 FISH 是利用荧光素标记的核酸探针对CTCs 进行检测。 此方法加入探针技术具有更高的敏感度和特异性,但这些优势是在靶细胞的表面抗原标记是稳定状态下适用。 CanPatrol CTC分型检测技术运用纳米膜过滤和RNA 原位杂交技术，采用针对上皮、间质mRNA 的荧光探针进行细胞原位杂交，将CTC 分为上皮型、间质型和混合型，是实现分型分析的CTC 检测技术。

3 循环肿瘤细胞的临床应用

3.1 肿瘤的早期诊断 CTCs 是存在肿瘤患者血液中一种具有活性的肿瘤细胞,其与恶性肿瘤的复发和转移关系密切[12]。 随着对CTCs 不同检测技术和分析方法的发展和不断的深入认识,已越来越多将其应用于肿瘤早期诊断、肿瘤分期、恶性肿瘤的辅助诊断和预后评估。对于肿瘤做到早发现,早治疗，才能达到好的疗效,目前早期诊断一般为影像学检查，但该检查对直径小于5mm 的肿块难以发现，提示当前的早期诊断技术具有自身的局限性[13]。有研究发现，利用阴性富集法对CTCs 进行检测，发现原发性肺癌CTCs 阳性率（84%）明显高于肺良性疾病组（4%）[14]。 Ried 等[15]研究者使用ISET 技术发现，在无症状但为高危因素人群中检测到CTCs 的接近50%。这表明CTCs 对肺癌的早期诊断具有重要的价值。 季福庆等[16]对乳腺癌患者外周血中的CTCs 进行了检测,发现CTCs 与乳腺癌患者肿瘤细胞转移以及TNM 分期存在一定的相关性，对其临床指导和预后具有指导意义，另外，Zhao 等人在体外分离扩增培养CTCs, 建立了一株来源于乳腺癌晚期患者外周血中的CTCs 的细胞系,并命名为CT C-3[17]，目前对其单细胞测序进行分析，旨在筛选出CTCs 特有的敏感性和特异性强的乳腺癌耐药基因为寻找乳腺癌早期诊断提供科学依据。

3.2 肿瘤的分期及预后评估 CTCs 计数和表型的转变能够辅助肿瘤的定性及恶性程度的判断，CTCs 计数越多提示病灶临床分期可能越晚，可在一定程度上指导临床决策。 对转移肿瘤患者进行预后评估是目前CTC 临床应用最广泛的领域。 恶性肿瘤患者治疗前后的CTC 类型和数目的变化具有重要的预后提示价值。 大量实验证明CTC 的出现与晚期癌症患者的预后密切相关[18,19]。 CTC 检测作为一种简单的血液检测可随时获取用于评估患者的预后。

3.3 肿瘤的疗效评价与用药指导 抗肿瘤治疗的疗效监测是CTCs 另一重要临床应用。 CTCs 检测可作为影像学及临床评分体系的补充,对患者的治疗应答作出评价。 如在药物治疗后1~2 周, 通过CTCs 的检测, 可观察循环细胞类型和数量的改变预测治疗效果。 CTCs 对化疗疗效评估已被多项研究证实[20,21]。 CTC 检测不仅可提供预后预测、复发风险评估和疗效监测, 同时CTC 的分子分析还可以反映患者肿瘤的基因信息，指导个体化用药。

4 展望

CTCs 携带了肿瘤细胞的遗传和生物学信息，可为肿瘤转移、进展及化疗敏感和耐药性提供新的研究方向。 但目前对CTCs 的检测技术仍不断在完善,在世界范围尚无一个测定与临床应用的行业标准。 要实现CTCs 在肿瘤精准诊疗中的应用，未来可从CTCs 的富集、鉴定、计数到下游分析，利用纳米芯片技术实现特异性的无损释放富集到的CTCs[22], 并通过数字PCR 检测技术和单细胞测序等技术,比较CTCs 与原发灶、转移灶中基因组、转录组及表观遗传组的差异,为认识肿瘤发生、发展及转移的生物学机制提供新的视角。 相比通过肿瘤组织标本鉴定基因组变化和基因表达改变的传统模式,CTCs 携带的组学信息更具有研究意义,可准确和全面的提供癌症转移机制和获得性耐药的肿瘤遗传学改变的信息[23-25]。 其次可以通过体外培养扩增肿瘤患者外周血中稀少的CTCs, 获取足够多的细胞，对其进行基因、蛋白、功能等各个层面的分析对于肿瘤精准医疗具有重要的临床意义。 体外培养扩增的CTCs 可用于构建动物模型、耐药及药物敏感性试验[26]等临床前实验，并提高CTCs 表型分析的精度鉴别出真正导致转移的CTC 亚群的分子特征,进而以之构建转移干预药物的体外筛选平台。 对于CTCs 的研究将有利于肿瘤患者早期诊断、辅助临床进行精确治疗、术后肿瘤复发与转移及预后评估。