花生突变体研究进展

苑翠玲 闫彩霞 赵小波 王 娟 李春娟 孙全喜 单世华

(山东省花生研究所,山东 青岛 266100)

花生(Arachis hypogaeaL.)是我国重要的油料作物,是食用油脂重要供应来源。培育多抗、优质、高产新品种是花生育种工作者主要的研究方向。然而,目前我国推广的花生品种大多系谱狭窄,90%以上的品种以“伏花生”和“狮头企”作为骨干亲本或含有他们的血缘[1]。这种对少数骨干亲本的依赖现象导致遗传基础狭窄,是目前花生育种工作面临的主要瓶颈[2]。挖掘或创制新的种质资源已成为育种工作者的首要任务。从农家品种、野生种、国外引进资源中挖掘和利用新的基因是一个重要方向[3],但仍然存在可利用资源有限、远缘杂交困难等问题。突变体创制成为挖掘新种质进而培育新品种的重要途径;同时,突变体也可作为功能基因组学的研究材料。本文就植物突变体创造途径、花生突变体研究现状及利用情况进行了概述,并对下一步工作进行了展望,旨在为花生突变体的创制和利用提供参考。

1 植物突变体创造途径

1.1 自然突变

自然突变是不经任何人工处理,在自然条件影响下产生的变异。这种突变体避免了人们对食品安全性的担忧,但突变发生频率极低、难度较大。利用具有优异性状的自然突变体已经育成了不少农作物新品种。比如国宝太谷核不育小麦即由一个编码“孤儿蛋白”的基因自然突变而来[4],该材料的利用大大提高了小麦育种效率,培育了一批优异小麦品种[5]。

1.2 物理诱变

1.3 化学诱变

化学诱变是利用化学诱变剂[如:甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)、叠氮化钠、秋水仙素等]处理植物材料,诱发遗传物质发生改变,从而引起植物表型的变异。在众多化学诱变剂中,EMS 被认为是应用最好的化学诱变剂,具有可操作性强、简便易行等优势,且容易得到稳定的突变体,一般到M3 即可稳定遗传。EMS 突变体由于遗传背景单一,是遗传育种和分子生物学研究的理想材料,在国内外已成为一种成熟的技术[9],被广泛应用于农作物诱变育种和功能基因组学研究。在水稻[10]、玉米[11]和小麦[12]等作物中,借助EMS 诱变已经获得了大量的品种或品系,并被应用于基因功能鉴定工作中。

TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes)技术是结合EMS 诱变群体构建和PCR 定向筛选技术而发展起来的检测点突变的反向遗传学研究方法,具有通量高、成本低、不依赖基因型等特点[13],主要包括突变群体的构建和随机突变的筛选。一般采用EMS处理获得突变群体,用CELⅠ酶酶切目的基因PCR 产物,借助电泳筛选突变材料。TILLING 技术最早应用于拟南芥[14],随后陆续在玉米[15]、小麦[16]、大豆[17]等作物中广泛应用。

1.4 分子生物学方法

随着生物技术的快速发展,借助转基因技术创制突变体越来越受到科研人员的青睐,如插入突变[18]和基因组编辑[19]等,插入突变包括T-DNA 插入[20]和转座子插入[21]等。二者均需要借助转基因将外源已知插入元件(T-DNA或转座子)随机插入受体植物基因组中,破坏插入位点基因的正常表达,从而引起植株表型的改变。插入突变技术已被广泛应用于拟南芥、水稻等易于转化的植物突变体库的构建[22-25]。尽管这种方法具有很大的随机性和局限性,但这些突变体库的创制和利用极大地促进了植物功能基因组学研究的发展。

近几年,科学家创造出能够按照人们意愿特异切割DNA的序列特异核酸酶,实现了对基因组特定位点的靶向修饰,即基因组编辑技术,包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术等[26]。其中,CRISPR 技术已经成为近年的研究热点,已被广泛应用于农作物遗传改良中,并取得了巨大进展。科学家利用CRISPR 技术创制了高通量的水稻突变体库[27],开发了简单高效的配套的突变体筛选方法[28]:基因组编辑蘑菇已经获准种植和销售,并得到美国政府的上市许可[29]。

2 花生突变体研究进展

目前,已经有大量具有优异性状的花生突变体被发现或创制,并被应用到花生新品种培育中。其中,研究最透彻、应用最广泛的是脂肪酸去饱和酶2(Fatty acid desaturase2,FAD2)基因的突变体。花生FAD2基因编码的脂肪酸去饱和酶可以将油酸转化成亚油酸,该基因突变后,亚油酸合成受抑制,从而得到油酸含量提高的花生,即高油酸花生[30]。

2.1 自然突变体

1987年,Norden 等[31]发现了花生FAD2基因第一个自然突变体F435,油酸含量高达80%。目前美国大部分高油酸花生品种(如Sunoleic 97R、Tamrun OL07、Florida-07 等)都直接或间接选育自该突变体[32]。Wang 等[33]筛选了4 000 余份花生种质,鉴定出2 份高油酸自然突变体PI342664和PI342666,这两份材料均收集自巴基斯坦西部;姜慧芳等[34]对5 700 份花生种质资源进行鉴定评价,筛选出18 份油酸含量达67%以上的高油酸材料;王传堂等[35]从花生栽培种与不亲和野生种杂种后代中鉴定出高油酸自然突变体,获得了丰产性较好的高油酸大花生新材料。

2.2 物理诱变突变体

大部分物理诱变是借助γ-射线辐射花生干种子,对后代进行表型鉴定,筛选具有感兴趣性状的突变体材料。邱庆树等[36]用γ-射线辐射白沙1016,获得38个可稳定遗传的具有不同性状的突变体;姜德锋等[37]以鲁花11号干种子为诱变材料,采用γ-射线辐射处理,在后代中选出大果和金黄色内种皮的品系;禹山林等[38]用γ-射线照射白沙1016、徐州68-4、花27 干种子,获得了白叶脉、叶片较小的突变体;李欢倪等[39]利用快中子辐射山花13号的干种子,获得了一个性状稳定遗传的花生半矮化突变体sdm1(semi-dwarf mutant 1)。以上突变体的创制为花生大小果、叶片大小、内种皮颜色以及株高等性状研究提供了很好的材料。研究者利用γ-射线辐射也创制了高油酸花生材料。Chu等[40]利用γ-射线辐射Georia Runner,获得高油酸突变体,命名为GA-T2636M;Yu 等[41]利用γ-射线辐射79266 获得的高油酸突变体SPI098,是我国创制的第一个高油酸花生突变体,为我国高油酸花生育种研究提供了重要材料。

借助航天育种也获得了一些变异后代,并培育出了一些花生新品种或品系。河北省唐山市农业科学院借助航天技术选育出了高产、优质花生新品种唐花11号,并育成两个高蛋白花生新品系K2-5-6和K2-33-9[42]。河南省濮阳市农业科学院将濮珍花1号搭载卫星遨游育太空15 d,返回地面后,经系统选育获得豫航花1号[43]。广东省农业科学院作物研究所通过卫星搭载粤油7号种子,返回地面后在后代中发现荚果大小、形状和种皮颜色变异新材料,并先后育成了航花1号、航花2号和航花3号等[44]。

由此可知，圆了在学生时期追究西洋哲学的同时，首先追究中国哲学，阐明这点的是中国古代思想史专家佐藤将之。[注]参见佐藤将之：《井上圆了思想における中国哲学の位置》，《井上圆了センター年报》第21号，2012年9月，第31—32页。

辐射诱变育种具有变异频率高、变异范围大、后代稳定快等优点,极大缩短了花生育种年限。

2.3 化学诱变突变体

化学诱变操作简单方便,已被广泛用于花生突变体的创制。研究者分别利用不同的化学诱变剂,获得了具有不同优异性状的花生突变后代,并用于新品种培育和分子机理研究。其中,应用最多的化学诱变剂是EMS。

王允等[45]将不同浓度EMS 溶液注入花生花器,获得了大量株高、株型、生育期、育性及荚果大小等性状改变的突变体。Wang 等[46]通过EMS 注射花生花器,获得了高产性状能够稳定遗传的超大果和超小果突变体,后代产量显著增加。徐倩玉[47]利用EMS处理获得了抗唑嘧磺草胺和双氟磺草胺的花生种质。胡晓辉等[48]用EMS处理强休眠性的花育52号种子,获得了丧失休眠性的突变体HY52-100-23和HY52-10-67,且被应用于花生种子休眠机理的研究。杨富军等[49]通过不同EMS 浓度梯度和时间梯度处理四粒红和白沙1016,最终筛选获得了3个高产株系。Han等[50]用EMS处理抗叶斑病的远杂9102,得到抗性丧失的突变体材料M14,并用于花生抗叶斑病机制的研究。Wan 等[51]用EMS处理中花16,得到荚果变小的突变后代,利用此材料开展了荚果大小机理的研究。此外,刘泽等[52]用0.1%秋水仙素溶液处理皖花4号,筛选获得了一些早熟品系。

利用化学诱变的方法,也获得了一些高油酸花生材料。Fang 等[53]用EMS处理鲁丰2号,获得了油酸含量显著提高的突变体。Knoll 等[54]用EMS 溶液处理Tifrunner,借助TILLING 技术筛选到了两个花生主要过敏源基因Arah1和Arah2和一个高油酸突变体。Zhuang 等[55]利用EMS 诱变剂和γ-射线分别处理闽花6号和闽花8号,获得了一批高油酸且较耐冷的品种和品系,经重测序发现FAD2A和FAD2B基因均有突变,这是首次人工一次诱变创制的双基因隐性突变高油酸新品系。此外,Wang 等[56]利用叠氮化钠处理花育22号,获得了油酸含量提高的突变体CTWE,这是我国高油酸花生品种的少数几个亲本之一。

2.4 基因组编辑突变体

随着生物技术的发展,利用基因组编辑技术对花生目的基因进行定点修饰的报道也陆续出现。Wen等[57]借助TALEN 技术,获得了FAD2基因的突变体,转基因花生种子中油酸含量得到显著提高,这是首次借助基因组编辑技术获得转基因花生突变体的报道。Yuan 等[58]借助CRISPR 技术成功在原生质体和发根(hairy root)中定点突变了FAD2基因,FAD2A出现G448 突变位点,FAD2B出现441_442insA和G451T 突变位点,其中G448A和441_442insA 与现有高油酸材料突变位点一致,G451T是新的突变点,这是首次借助CRISPR 技术对花生基因进行定点编辑的报道,证明了该系统在花生基因组编辑中应用的可行性。

2.5 花生突变体库创制

利用物理或化学的方法对花生进行大规模诱变处理,从而获得突变体库,具有重要的理论意义和应用价值。从正向遗传学角度,可以挖掘具有优异性状的新材料,用于培育优异新品种;并定位或克隆该基因。从反向遗传学角度,可以筛选感兴趣基因的突变体,鉴定基因的功能。该方面的研究逐渐引起了花生科研工作者的重视。

侯蕾等[59]利用EMS、60Co-γ射线以及快中子辐射处理花生品种丰花1号、山花13和潍花10号等10个主要推广的栽培花生品种的成熟种子,共获得30 000 余株M1个体,M2 在叶片形态、植株形态、荚果与种子表型及种子成分上均出现变异表型。彭振英等[60]对花生干种子进行60Co-γ 辐射诱变处理并构建花生突变体库,获得了一些有价值的突变体材料,如高油、高蛋白、大种子和小种子、大叶和小叶、卷叶等。韩锁义等[61]采用EMS处理阜花10号构建花生突变体库,获得了104 份叶、茎和种子变异的突变体。宋佳静[62]用离子束和EMS 诱变处理花生品系416和606的种子和花器,获得了一个具有丰富表型变异的突变体库,后代涉及株高、生育期、育性、多分枝、荚果大小、叶型、品质等变异。这些花生突变体库的建立,极大的丰富了花生种质资源。然而,这些研究并未对突变质量进行评价,也没有借助TILLING 技术对优异基因突变体进行筛选。

3 花生突变体的应用

综上所述,研究者借助各种途径创制了一批优异花生突变体,并利用这些突变体材料培育出大量优异花生品种或品系。其中,应用最多的是FAD2基因的突变体,即高油酸花生。

3.1 高油酸花生突变体的应用

高油酸花生具有贮藏期长等优点,也是目前花生育种的一个重要目标。利用FAD2基因突变体已经育成大量高油酸花生品种[30,32,63]。截至2016年,美国已经育成47个高油酸花生品种[63],我国育成了38个高油酸花生品种[30]。这些品种的亲本都来自FAD2 基因的突变体或其衍生物(如F435、SPI098、P76、CTWE等)。

广西农业科学院利用从美国引进的高油酸种质SunOleic 95R 育成了高油酸品种桂花37[64];青岛福德隆种业有限公司利用SunOleic 95R 育成了富花1号;山东省花生研究所利用SPI098、P76和CTWE 育成了花育32号、花育51号、花育52号、花育951、花育961和花育662 等高油酸新品种。此外,利用高油酸材料开选01-6,河南省开封市农林科学院和河北农林科学院分别育成了开农61、开农176、开农58、开农1715、冀花11、冀花13、冀花18和冀花20 等高油酸品种。利用高油酸突变体或衍生物育成的一系列高油酸品种,已在多篇文献[30,32,63]中进行综述。

3.2 其他花生突变体的应用

除了高油酸花生,花生科研工作者借助诱变技术创制的突变体材料,也育成了一些具有其他优异性状(如高产、高油、抗逆等)的新品种或品系。江西省抚州地区农科所采用60Co-γ射线处理粤油551 育成了赣花二号[65]。利用辐射创制的普通型大果突变体RP1 育成了高产、优质、抗逆性强、适应性广的出口花生品种8130[66]。唐月异等[67]用EMS 注入花育16号开放的花朵,选育出了高产稳定、高出米率、适宜机械化收获的新品种花育40。刘风珍[68]利用79266和鲁花11 杂交获得的F1种子经60Co-γ 辐射后系统选育出了山花13。湖南农业大学利用中花4号干种子采用γ-射线辐射育成了湘花5009。广东省汕头市农业科学研究所通过60Co-γ 辐射诱变汕油212 育成高油高产花生新品种汕油辐1号[69]。此外,青岛农业大学利用辐射诱变结合组培再生等方法育成了一系列优异品种,如宇花1号、宇花3号、宇花5号、宇花6号、宇花7号和宇花10号等(育自鲁花11),以及宇花4号、宇花9号、宇花14和宇花16 来自花育20;宇花4号和宇花8号(育自花育22)。

通过筛选自然变异株的方法也育成了一系列花生新品种。如,雒花86 选自誉宇11号变异单株,鲁花10号选自花17,科花1号选自徐州68-4,青花1号选自丰花1号。

4 结论与展望

研究者陆续创制了一批花生突变体,并以此育成了一些新品种。然而,利用反向遗传学研究基因功能,需要借助突变体表型鉴定来完成,筛选目的基因的突变体也是一项重要工作。因此,应加强对花生目的基因突变体筛选鉴定方面的研究。

4.1 创建突变位点饱和、表型丰富的花生EMS 突变体库,完善配套的TILLING 筛选平台

EMS 诱变操作简单、随机性好,是目前突变体创制最常用的手段。不同花生品种所需要的EMS 工作浓度和处理时间不同。要达到理想的诱变效果,研究者需要根据试验目的,探索EMS 诱变条件,创制一个突变位点饱和、表型丰富的花生突变体库,并通过田间性状调查,记录每个突变后代的性状。研究者可以筛选感兴趣性状的突变体(如耐盐、抗病等),一方面可以借助杂交等常规手段,培育花生新品种;另一方面可以以突变体为亲本,构建杂交群体,对重要性状基因进行图位克隆。

TILLING 技术是在其他作物中很成熟的一种筛选目的基因突变体的方法。随着花生野生种和栽培种基因组测序的完成,将会有越来越多的功能基因被克隆鉴定,这对于研究基因功能具有重要作用。应完善花生TILLING 筛选平台,充分利用突变体库,对感兴趣基因的突变体进行筛选,并用于基因突变后代表型的鉴定。

4.2 优化花生组培再生及遗传转化体系,建立稳定的花生CRISPR 技术

CRISPR 技术可以实现对目的基因的精确改变,是实现花生遗传改良或功能基因研究的一种强有力手段。Yuan 等[58]借助该技术在花生原生质体和发根中实现了对FAD2基因的定点修饰。目前,虽然有不少花生转基因成功的报道,但是鲜有利用CRISPR 技术实现对花生目的基因修饰并稳定遗传的报道,这可能与花生遗传转化体系不成熟等有关。因此,迫切需要优化花生组培再生及遗传转化平台,建立稳定的花生CRISPR 定点突变技术,以实现对花生重要功能基因的精确修饰。