炎性标志物与缺血性卒中的研究进展

脑梗死是指各种原因导致的脑内血液供应障碍，引起脑组织缺血、缺氧性坏死。脑血流中断5 min，神经细胞将出现不可逆损害。脑梗死病灶由缺血中心区和周围的缺血半暗带组成。缺血半暗带恰好是局部缺血引起炎症，造成脑损伤的关键部位。半暗带虽然有损伤，但仍然有大量存活的神经元，及时给予正确的治疗，可以逆转脑组织损伤。因此探讨缺血性脑卒中的炎性发生机制，合理利用炎性标志物，对脑卒中的诊断和预后评价尤为重要。阻断炎性通路，减轻神经元损伤，将成为治疗缺血性卒中的重要治疗靶点之一。

1 脑梗死的炎性细胞反应

脑缺血触发的炎性级联反应是一个极为复杂的过程，涉及多种炎性细胞、炎性介质和多条炎性通路。脑缺血引起的急性炎性反应以脑组织内小胶质细胞和星形胶质细胞的激活以及外周血白细胞浸润脑实质为特征。

1.1 白细胞 急性脑卒中后，中性粒细胞最先进入缺血脑组织，释放一系列促炎介质，淋巴细胞次之(卒中后3～6 d)；外周血中的单核细胞迅速迁移至脑缺血损伤处，形成小胶质细胞或巨噬细胞，清除坏死组织。单核细胞和巨噬细胞同时表达抗炎和促炎介质，起双重作用。单核细胞分为促炎型(Ly-6Chigh/CCR2+)和抗炎型(Ly-6Clow/CCR2-)。巨噬细胞分为MI炎症型和M2抗炎型。低温疗法有利于M1型向M2型转化[1]，发挥抗炎作用。不同类型的淋巴细胞对脑卒中的影响机制暂未明确。Wang等[2]发现，卒中病人T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞水平明显低于正常人，T淋巴细胞和B淋巴细胞含量与卒中严重程度呈负相关。Michael等[3]发现，B淋巴细胞对梗死面积无影响，而T淋巴细胞在卒中炎性反应中发挥着重要作用。CD4+、CD8+和γδT细胞通过释放促炎细胞因子IFN-γ、IL-17等损伤梗死区脑组织。相反，调节T细胞(Treg细胞)通过释放抗炎细胞因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)等保护脑组织[4]。抗CD28抗体(CD28SA)通过增加Treg细胞数量，减小梗死面积，改善功能缺损[5]。

1.2 小胶质细胞和星型胶质细胞 小胶质细胞为脑内固有免疫细胞，具有清除坏死组织的作用。在急性期，一方面小胶质细胞迅速活化释放炎性介质，加快细胞损伤和死亡；另一方面，胶质原纤维酸性蛋白释放增加，小胶质细胞会聚集在损伤区域，产生“无菌性免疫反应”。然而，Kanazawa等[6]用缺氧缺糖预处理小胶质细胞，28 d后，实验组神经功能恢复明显优于对照组，说明晚期小胶质细胞具有神经保护的作用。小胶质细胞的双重作用可能与小胶质细胞的活化时间相关。有研究表明，小胶质细胞早期活化时有害而晚期活化能促进脑功能恢复[7]。星型胶质细胞在损伤前期会释放一系列炎性介质、组织相容性复合物、共刺激分子，激活炎性反应；后期则表现为清除坏死组织与修复神经元。

2 炎性标志物及信号通路

2.1 炎性标志物

2.1.1 细胞因子

2.1.1.1 促炎细胞因子:(1)TNF-α：小胶质细胞中可见大量TNF-α表达，通常认为，TNF-α介导炎性损伤，阻断TNF-α有利于减轻脑内炎性反应。但有研究发现，TNF-α除了有神经毒性，也可发挥神经保护作用。TNF-α的双重作用与以下两点相关。①与TNF-α的分布相关：分布于纹状体的TNF-α将导致神经退行性变，而分布于海马旁回多有神经保护作用[8]。②与TNF-α的结合受体相关：可溶性TNF-α与TNF受体1结合，介导神经损伤；膜结合型TNF-α与TNF受体2结合，介导神经保护[9]。低温疗法通过减少TNF-α、IL-1β等促炎因子表达，促进IL-10、TGF-β等抗炎因子表达，减轻炎性反应，改善脑功能[10]。

(2)IL-1：与包括卒中在内的人类多种疾病的发病机制密切相关，主要存在形式包括IL-1α、IL-1β。脑缺血数分钟内IL-1α、IL-1β水平均会升高，IL-1β升高更明显。实验发现，与对照组相比，IL-1β敲除组小鼠梗死面积更小，证明IL-1β较IL-1α与缺血性卒中关系更加密切相关[11]。有趣的是，IL-1并没有直接的细胞毒性，而是通过激活星型胶质细胞或内皮细胞，释放炎性因子、血管黏附分子等间接途径产生炎性损伤[8]。Pradillo等[12]在大脑中动脉缺血(MCAO)模型鼠中应用IL-1受体阻滞剂，MRI影像上可观察到梗死面积减小50%。

(3)IL-6:卒中病人血清及脑脊液中均可表达IL-6，IL-6水平与卒中严重程度呈正相关。IL-6在缺血性卒中过程中发挥的作用尚有争议。通常认为，IL-6是一种重要的促炎细胞因子，缺血后3 h开始表达，12 h达峰，24 h内IL-6水平持续增高。但也有实验发现，IL-6敲除组小鼠梗死面积与野生鼠相比未见明显差异[13]。甚至有研究发现，应用重组人IL-6可明显减轻缺血损伤，证明IL-6可能发挥着抗炎作用[14]。此外，IL-6受体多态性尽管不增加缺血性卒中风险，但与预后不良密切相关。因此，IL-6或许可作为评价卒中预后的指标之一。

2.1.1.2 抗炎细胞因子:(1)IL-10: 除星形胶质细胞和小胶质细胞外，Treg细胞也可产生IL-10[4]，抑制炎性细胞因子受体的激活和表达，是阻断IL-1和TNF-α的重要抗炎细胞因子[15]。临床试验发现，IL-10水平低的病人，卒中风险大大增高[16]。

(2)肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样蛋白2(TNF-α-inducible protein 8-like 2，TIPE2/TNFAIP8L2)：是近来新发现的抗炎蛋白，在小胶质细胞和巨噬细胞中都高表达。TIPE2通过负性调节T细胞受体和Toll样受体维持免疫平衡。MACO模型鼠中，阻断TIPE2，炎性细胞因子表达增加，梗死面积变大，神经功能缺损症状加重。未来，TIPE2有望成为新的抗炎治疗靶点。

(3)类胰岛素1号生长因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)：是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质，具有降血糖、降血脂、舒张血管、促进细胞分化等多种作用。IGF-1不仅直接对受损神经元产生保护作用，还能抑制血脑屏障通透性，促进M2抗炎型小胶质细胞生长，抑制M1型的激活。临床发现，升高IGF-1，有利于缺血性卒中病人神经功能的恢复[17]。

2.1.2 趋化因子:趋化因子是一类趋化炎性细胞迁移、介导炎性损伤的小分子多肽。根据靠近N端的前两个半胱氨酸(C)之间是否插入其他氨基酸，趋化因子共分为C、CC、CXC和CX3C四个亚类。

单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor,SDF-1)、不规则趋化因子(fractalkine，FKN)是研究最多的促炎趋化因子。正常脑组织几乎不表达MCP-1。脑缺血时，MCP-1能特异性趋化单核细胞浸润脑实质，促进黏附分子表达上调，造成缺血性脑损伤。实验发现，MCP-1基因敲除组小鼠炎性因子表达较少，梗死体积减小，脑损伤减轻[18]。此外，MCP-1与其受体相互作用，能降低卒中后出血转化几率。Ruscher等[19]发现，阻断SDF-1与其受体结合，能显著减少白细胞浸润及炎性因子释放，血脑屏障破裂受限。同时SDF-1能促进骨髓干细胞向缺血脑组织迁移，改善局部脑血供[20]，从而减轻炎性反应，减小梗死面积。FKN是CX3C家族唯一成员，具有促进内皮细胞表达黏附分子，趋化炎性细胞与血管内皮黏附的作用。炎性状态下，FKN能显著抑制小胶质细胞释放TNF-α、IL-6等，减少神经元死亡。

2.1.3 黏附分子:黏附分子通过促进白细胞向脑实质浸润，参与炎性反应。免疫细胞和血管内皮之间的相互作用主要包括白细胞滚动、募集、跨内皮迁移3个步骤，通过3类黏附分子介导。(1)选择素：P-选择素、E-选择素、L-选择素；(2)免疫球蛋白超家族：细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecules，ICAM)-1，ICAM-2、血管细胞黏附分子(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)、血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)、黏膜血管定居因子(mucosal vascular addressing cell adhesion molecule-1，MAdCAM-1)；(3)整合素：CD11a、CD11b。

2.1.3.1 免疫球蛋白超家族：目前研究最多的免疫球蛋白超家族成员是ICAM-1和VCAM-1。ICAM-1主要分布在内皮细胞、白细胞、上皮细胞表面，正常内皮中几乎不表达。临床发现，急性脑卒中病人血浆和脑脊液中ICAM-1和VCAM-1水平均升高，且与卒中严重程度相关[15]。用ICAM-1抗体阻断ICAM-1，可减少白细胞向内皮细胞黏附，从而减轻脑损伤[21]。基于此，ICAM-1似乎是脑卒中新的治疗靶点。然而在一项应用抗ICAM治疗脑卒中的三期临床实验中发现，抗ICAM治疗不仅不能改善卒中预后，反而加重，可能与实验中ICAM抗体来源于鼠，并在体内通过补体激活途径激活中性粒细胞有关。VCAM-1对脑卒中的影响尚有争议。有研究发现，脑缺血后VCAM-1蛋白和mRNA水平均升高[22]。在缺血再灌注(tMACO)和永久阻塞(pMACO)2种模型中应用CD49d抗体，均能抑制白细胞浸润，减小梗死体积[23]。

2.1.3.2 选择素：白细胞从血管向组织迁移是炎症发生的核心环节，而这一过程是由P、E、L 3种选择素共同介导的。P选择素和E选择素主要参与白细胞滚动和募集。P选择素过表达鼠梗死灶体积更大，阻断P选择素或E选择素有利于减轻炎性损伤，促进神经功能恢复[15]。另有研究发现，脑缺血范围不同，P选择素的作用并不一致。局灶性脑缺血模型中，P选择素基因敲除鼠神经功能缺损减轻。全脑缺血模型中，阻断P选择素尽管仍然能减少白细胞滚动，但生存率反而降低[24]。E选择素能增加缺血性卒中的发病概率。L选择素的作用尚未明确。尽管发现L选择素可以介导白细胞募集，但在MCAO模型中使用L选择素抗体，对脑卒中预后并无影响。

2.1.3.3 整合素：血液中的白细胞必须依赖整合素识别内皮细胞上的黏附分子，与之结合，才能穿越血管壁，浸润脑组织，是缺血损伤发生的必要条件。Kawabori等[15]发现，阻断CD11b/CD18，试验组脑缺血灶内浸润的中性粒细胞数量明显下降，神经元损伤减轻，梗死面积下降。

2.1.4 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)：MMPs是一种锌依赖的水解蛋白酶，具有降解细胞外基质、促进炎性因子和中性粒细胞迁移的作用。在已报道的26种MMPs中，MMP-2和MMP-9与脑血管病密切相关。正常脑组织中，MMP-2和MMP-9呈无活性的低表达。缺血缺氧或炎性条件下，小胶质细胞、星型胶质细胞合成MMP-2和MMP-9增加。在炎症的不同阶段，MMP-9起双向作用。早期，MMP-9降解细胞外基质，破坏血脑屏障，引起水肿、出血甚至神经元死亡；而在晚期，MMP-9通过与血管内皮生长因子(VEGF)等生长因子共同参与血管再生，减轻脑损伤。

2.1.5 活性氧族(ROS)：脑缺血后，脑血流量急剧下降，氧糖剥夺，线粒体被破坏，产生大量氧自由基，刺激ROS系统激活。卒中的研究重点主要是NADPH氧化酶(NOX)。研究证实，NOX1、NOX2、NOX4与缺血损伤密切相关。NOX2可能会促进斑块破裂，同时激活炎症凋亡反应，加重脑损伤。NOX4是氧化应激的主要来源，有学者认为，阻断NOX4，能减轻甚至逆转氧化反应，恢复神经功能，是抗氧化药物治疗卒中的思路来源之一[25]。

2.1.6 一氧化氮(nitric oxide，NO)：NO是一种相对稳定的气体，能弥散到细胞和细胞膜内，发挥宿主防御、血管张力调节、免疫调节等作用。与卒中相关的一氧化氮合成酶(NOS)主要有内皮型NOS(eNOS)、神经元型NOS(nNOS)和诱导型NOS(iNOS)3种，其中iNOS与脑缺血关系最为密切，淋巴细胞、小胶质细胞等炎性细胞中均可见到iNOS。脑缺血后，iNOS活性增高，NO合成增加，NO与过氧化物反应生成过氧化氮，直接导致DNA损伤。

2.1.7 花生四烯酸代谢途径：免疫细胞激活后，磷脂酶A2释放，启动花生四烯酸级联反应。脑卒中后，脑血流中断，钙离子内流、聚集，细胞内高浓度钙离子进一步活化磷脂酶A2，水解甘油磷脂，刺激花生四烯酸释放。花生四烯酸代谢产物通过增强免疫反应导致缺血性脑损伤加重。与野生型小鼠相比，磷脂酶A2缺陷鼠脑梗死面积更小，脑水肿程度更轻，预后更佳[4]。

2.2 炎性信号通路

2.2.1 Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)：TLRs是存在人细胞表面的Toll跨膜蛋白，因与果蝇Toll分子高度同源而得名，其不仅在小胶质细胞、星型胶质细胞、血管内皮细胞、神经元中表达，在免疫细胞中也有广泛表达。TLRs的胞外区富含亮氨酸重复序列，胞内区因与IL-1受体的胞内区同源，称为TIR区的跨膜受体。TLRs的胞外区先识别相应受体然后通过胞内区的TIR结构域进行信号传导。根据信号传导方式不同，主要分为髓系分化因子88(myloid differentiation factor 88,MyD88)依赖型和非依赖型两大类。除TLR3外，其余TLRs都是MyD88依赖型，通过调控NF-κB，进而启动IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达。TLR3通过激活I型干扰素，启动MyD88非依赖型途径。而TLR4，既可以启动MyD88依赖型模式，也可以启动MyD88非依赖型模式。

缺血后坏死细胞产生热休克蛋白、高迁移率族蛋白等内源性配体，激活TLRs特别是TLR2和TLR4，产生炎性介质，加上先天免疫反应，最终导致不可逆的脑损伤。临床试验发现，缺血性卒中病人外周血TLR2表达明显升高[26]。脑缺血45 min后动脉注射TLR2抗体(clone T 2.5)，CD11b阳性细胞数量减少，神经细胞死亡率明显下降[27]。然而，也有实验发现，脑缺血再灌注损伤24 h后，TLR2基因敲除鼠脑梗死面积更大，证明敲除TLR2并不能抑制NF-κB的激活，相反抑制PI3K/Akt信号通路，加重炎性损伤。不同实验中TLR2的双重作用机制尚未明确，可能与实验动物、造模类型、缺血再灌注时间、脑血流量等因素有关。相关分析提示TLR4与卒中严重程度密切相关。TLR4+单核细胞病人梗死体积明显增加[28]。组织激肽释放酶通过抑制TLR4/NF-κB，激活Nrf2信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激的作用，保护脑组织。

2.2.2 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases pathway, MAPKs)：MAPKs是细胞内重要的信号转导系统，将细胞外的各种刺激，通过MAPKKK、MAPKK、MAPKs等细胞内信号分子，逐级传递至细胞核内，对缺血缺氧等病理刺激作出不同的反应，直接调节转录因子，控制细胞的增殖、分化。

与脑缺血密切相关的MAPK通路主要有4条：应激活化蛋白激酶(the stress-activated protein kinases/c-Jun N-terminal kinases，SAPK/JNK)，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，细胞外信号调节蛋白激酶5(extracellular signal-regulated kinase5，ERK5)，细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)。缺血损伤后，这4条信号通路在神经元和星型胶质细胞中激活。但这些信号通路在脑缺血中所起的作用尚未完全明确。多项研究发现，JNK、p38的激活会导致神经细胞凋亡，ERK的激活有利于神经细胞缺血损伤恢复。

JNK信号通路可以促进IL-1、TNF-α等促炎细胞因子的产生。用银杏内酯治疗MCAO鼠，梗死灶体积、重量、神经功能缺损评分、脑水肿均显著下降，TNF-α、IL-1β表达减少，且能下调半暗带区域JNK1/2、p38 MAPK的表达，而对ERK1/2无影响[29]。p38 MAPK信号通路与JNK类似，通过激活小胶质细胞、星形胶质细胞产生促炎细胞因子。鼠MCAO模型中，胶质疤痕区可观察到p38 MAPK活化，胶质纤维酸性蛋白表达增加。抑制p38 MAPK可以减轻星形胶质细胞迁移，但不影响其增殖。然而在p38 MAPK敲除的pMCAO模型中，鼠的梗死面积和运动功能未见明显差异[30]。ERK5是最新发现的MAPK家族成员，其对卒中的影响机制并不明确。有研究发现，ERK5的激活有利于缺血保护[31]。针对JNK、p38 MAPK、ERK1/2信号通路的抑制剂将为缺血性卒中的治疗提供新思路。

2.2.3 转录因子: NF-κB 广泛存在于真核细胞内，对机体炎性反应和免疫调节有重要的调控作用。NF-κB主要由p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、p65(RelA)、RelB、cRel构成。NF-κB的抑制物IκB与NF-κB二聚体形成复合物存在于胞浆中。细胞受到外界刺激后，IκB被磷酸化降解，从复合物上解离，NF-κB进入细胞核，诱导黏附分子、趋化因子、MMPs等多种促炎因子的转录。

缺血损伤后，神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞中的NF-κB被激活，p65和p50表达增加，基因敲除p50后，梗死面积明显减小。用p50的抑制剂(S-亚硝基谷胱甘肽)也可观察到类似现象。

总之，脑缺血诱发炎性细胞、黏附分子、炎性介质、趋化因子等相互作用，形成所谓的炎性级联反应。损伤血管内皮细胞、细胞外基质及血脑屏障，导致脑水肿、脑出血，最终造成脑组织坏死。多项研究均已证明抑制炎性反应有利于促进脑功能恢复，因此抑制超早期炎症的不良反应，促进脑缺血后期脑组织恢复，将成为缺血性脑卒中治疗新的思路。