不同产地川芎UPLC指纹图谱研究

刘尹 郭伦锋 郑龙

(安康市中心医院药剂科，陕西 安康 725000)

川芎(LigusticumchuanxiongHort.)是伞形科藁本属多年草本植物干燥的根茎[1]，主要生长在四川的彭州和都江堰等地区的道地药材。川芎性温，味辛；归肝、心、胆经，最早记载于《神农本草经》，川芎是祛风止痛、活血行气的良药，川芎主要药效成分包括阿魏酸、总生物碱、挥发油和酚性成分等物质[2-3]。现代药理学研究[4-5]表明，川芎具有扩张冠脉血管，延缓外周动脉血管紧张，改善脑部部位循环，保护脑缺血损伤，抑制血小板聚集及抗血栓形成，抗氧化等药理作用。指纹图谱分析是对中药或天然药物质量的一种整体表达方式，能客观的体现中药的复杂性和整体性[6-7]。本实验所建立的UPLC指纹图谱鉴别方法，可操作性强，简单，专属性强，为有效、客观的评价川芎药材质量提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 (1)仪器：岛津LC-20ADXR型高效液相色谱仪，配备包括四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(PDA)(岛津公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BP210S电子天平(德国Sartorius公司)。(2)试剂：阿魏酸(批号为110807-201306，质量分数为99.0%)，洋川芎内脂Ⅰ(批号为150213，质量分数为98.0%)，均购自中国食品药品检定研究院；蒿本内酯(批号为MUST-11072416，质量分数为99.0%)，购自成都曼斯特生物科技有限公司；实验用甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。15批川芎药材来源于四川成都、彭山、湖北、浙江、云南等地，药材处理方法按照2015版药典要求切片，晒干，粉碎，过4号筛，备用。

1.2方法

1.2.1色谱条件 Accucore TC-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱，梯度程序为：0 min：5% A，2 min：10% A，25 min：40% A，30 min：60% A，35 min：90% A，45 min：5% A，检测波长280 nm；流速0.2 mL/min；进样量2 μL；柱温35°C。

1.2.2对照品溶液的制备 取阿魏酸、洋川芎内脂Ⅰ、蒿本内酯对照品适量，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加入70%甲醇，摇匀制成混合对照品溶液。

1.2.3供试品溶液制备 取川芎粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精

密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2 结 果

2.1系统适用性试验 将空白试剂(甲醇)、混合对照品溶液、供试品溶液，按“1.2.1项下”的色谱条件分别进样分析。对比三个色谱图，如图1所示。结果显示各成分相互之间均无明显干扰，分离度符合测定要求，且空白试剂也无干扰峰存在。

注：1.阿魏酸；2.洋川芎内脂I；3.蒿本内酯图1 空白溶液、混标、供试品UPLC色谱图

2.2精密度试验 将同一种供试品溶液，按“1.2.1项下”的色谱条件连续进样6次，每次进样2 μL，测定主要色谱峰的峰面积分值。计算参考峰面积RSD值，各共有峰相对保留时间的RSD值为0.56%～2.57%，表明精密度良好。

2.3稳定性试验 取同一批供试品溶液，按“1.2.1项下”的色谱条件，分别于制备后的0、2、4、8、12、24 h进样，进样量2 μL，测定主要色谱峰的峰面积分值。计算参考峰面积RSD值，各共有峰相对保留时间的RSD值为0.83%～1.24%。表明混合对照品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4重复性考察 按照“1.2.3项下”供试品溶液制备的方法平行制备6份供试品溶液，分别按上述色谱条件，进样量2 μL，测定主要色谱峰的峰面积分值。计算参考峰面积RSD值，各共有峰相对保留时间的RSD值为1.55%～3.73%，表明该方法的重复性较好。

2.5指纹图谱的建立 按“1.2.3项下”供试品制备方法制备15个不同产地川芎药材的供试品溶液，取供试品溶液各进样2 μL，以阿魏酸峰(2号)为参照物峰，理论板数不低于8 000。按“1.2.1”项下色谱条件分别测定，将15批样品测定数据以AIA格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)，采用相对保留时间作为唯一指标，利用中位数法，时间窗宽度设置值为0.1，多点校正后进行峰自动匹配，计算生成对照谱图R，生成的对照图谱和峰自动匹配后所有样品的UPLC指纹图谱如图2所示，再进行共有峰标定，最终标定了共有峰15个，编号为 S1～S15。 各特征峰相对稳定，具有指纹图谱特征性。以2号峰(阿魏酸)作为参照峰，标定15个共有峰的相对保留时间，结果显示各共有峰相对保留时间 RSD 在0.03%～0.68%，经混合对照品溶液谱图对比，确认了3个主要特征峰，分别是2号峰(阿魏酸)，3号峰(洋川芎内脂I)；11号峰(蒿本内酯)。

注：S1-S15.15批样品UPLC图；R.对照色谱图；2.阿魏酸；3.洋川芎内脂I；11.蒿本内酯图2 15批川芎样品色谱分析图

2.6川芎指纹图谱的评价 依照指纹图谱整体性、相似性的特征，对生成的指纹图谱进行指标评价，对15批不同产地川芎的指纹图谱(S1～S15)进行系统评价。结果，检测的相似度值均高于0.957，川芎药材相似度评价结果见表1。

表1 15批川芎药材相似度评价结果

2.73个指标成分峰面积值分析 以样品编号为横坐标，以阿魏酸、洋川芎内脂Ⅰ、蒿本内酯3 个峰总峰面积值为纵坐标，得出 15 批川芎 3 个共有峰总峰面积值曲线图，如图3所示。结果表明云南、四川、浙江产地的(S4～S8) 3个共有峰峰面积总值在所有样品中最大，总体含量最高，而彭山、汉中、成都(S9～S15)3个共有峰峰面积总值最小，总体含量最低，其中彭州、彭山、成都(S1～S3、S9～S11、S13～S15)三个产地组的组内的三个药材的3个共有峰峰面积接近，总体含量接近，同时表明来源于同一产地的川芎中的成分含量相近。综合含量分析结果可知，同产于四川的川芎，含量也有较为明显的差异，表明产地对川芎质量影响较大。

图3 15批川芎阿魏酸、洋川芎内脂Ⅰ、蒿本内酯总峰面积值曲线图

3 讨 论

本实验以PAD检测器对不同的川芎样品进行全波长扫描发现，大部分共有峰成分在280 nm波长下有较好吸收，且基线平稳，峰高度较好，峰形较佳，因此确定280 nm为指纹图谱检测波长。试验考察了甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、分别作为流动相系统，最终选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相梯度洗脱，各色谱峰的峰形较好，能达到基线分离。考察了1、2、4、5 μL等不同样品进样量，考察25°C、30°C、35°C、等不同柱温，以及0.1 mL/min、0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.5 mL/min等不同流速。综合考虑其他目标峰的情况，最终选定的检测条件为：乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，检测波长280 nm，流速0.2 mL/min，进样量2μL，柱温35°C为较适宜色谱条件。对比超声法和加热回流法提取下的色谱图，确定“1.2.3”项下的提取方法。

目前，在现有的文献报道中大多采用对川芎有效成分含量测定，片面的以含量的高低，进行川芎质量评价，但这种单一的方式难以反映中药整体质量[8]。本实验所建立川芎检测和分析方法可以有效的评价药材内在品质和差异性，同时又能为含量检测方法提供一定的支撑，综合结果表明本研究建立的川芎指纹图谱重复性好，方法可行，可作为质量评价的方法。