转BpLTP4烟草耐盐性分析

石晶静 郭依萍 于颖 周美琪 王超

（东北林业大学 东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）

植物生长过程中可能会受到多种不良环境的影响，比如高盐、高温、干旱、低温等。高盐土壤会导致植物生长代谢紊乱，进而影响植物的正常生长发育。白桦（B. platyphyllaSuks.）是一个北温带的广布种，生长迅速，基本密度、木材硬度、白度、纤维形态、化学组分及打浆性能均符合造纸用材的要求，是优良的短周期阔叶纸浆用材树种，具有全球范围内的广阔的发展前景。鉴定白桦耐盐相关基因，研究其耐盐机制，利用分子育种手段培育耐盐白桦新品种，对于困难立地条件下白桦用材林和纸浆材林建设具有重要意义。

高盐土壤会诱导植物体内特异蛋白过量表达，有研究显示脂质转运蛋白（Lipid transfer proteins，LTP）作为植物体内的防御性蛋白在抵抗非生物胁迫中有重要的作用［1］。Kader［2］在研究脂质转运过程时发现在细胞膜上有蛋白可以转运磷脂并且与脂肪酸物质特异性结合。因此，将这一蛋白命名为脂质转运蛋白。LTP是一种小分子碱性可溶蛋白，在可溶性蛋白中占4%［3］。LTP蛋白的二级结构主要由H1、H2和H3和H4四个a-螺旋构成，并形成一个稳定的空间结构［4］。LTP蛋白的三维结构含有一个内嵌的疏水腔，推测疏水腔与磷脂等疏水分子形成复合体从而实现磷脂转运。盐害不仅会影响植物体内特定酶活性还会影响植物的代谢途径。有研究发现盐胁迫可以直接影响植物细胞的膜脂和膜蛋白，加剧膜脂的氧化程度，增大脂膜的透性，破坏植物细胞膜的完整性，直接导致细胞内的电解质和小分子的有机物渗透，破坏物质交换的平衡［5］。植物会通过改变自身的生理和新陈代谢的途径来抵抗盐胁迫对植物细胞膜造成的损伤。因此，研究重点开始集中于膜透性的变化［6］。LTP可以在生物膜之间转运脂质，因此推测其在植物抗逆过程中起重要的作用［7］。Torres-Schumann等［8］在盐胁迫处理番茄后发现，胁迫6 h后LTP开始实现诱导表达，胁迫12 h后LTP表达量达到最大值。Rabbani等［9］研究发现高盐胁迫水稻后可以诱导LTP表达。Jang等［10］研究小麦TaLTP1启动子发现，在盐胁迫下LTP显著上调表达。李诚斌等［11］将巴西旱稻中的OsLTP1通过农杆菌介导法转化水稻日本晴中并进行耐盐分析发现，转基因植物在1.5%的NaCl培养基中的生长能力明显高于对照株系，说明转基因水稻较对照株系更具有耐盐性。刘关君等［12］发现盐胁迫能够诱导西伯利亚寥nsLTP在不同组织中表达。拟南芥中存在耐盐LTP［13］，LTP在植物抗盐的过程中扮演着重要的角色［14］。但目前对于LTP响应盐胁迫的分子基础尚不清楚。

本研究利用拟南芥LTP序列与白桦基因组数据库进行比对，筛选并克隆白桦LTP，研究其序列特征及盐胁迫响应，并将其转入烟草，对其耐盐性进行分析，旨为研究LTP的耐盐分子调控机制及分子遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

提取RNA的材料为野生型白桦组培苗，培养于东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室组织培养室，温度为25℃，16 h光照/8 h黑暗，光照强度400 μmol/m2s。将东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存的SR-1烟草（Nicotiana tabacumL.cv.Petit Havana SR-1）种子用1 mL 20%的NaClO清洗；之后用无菌水清洗，将清洗后的种子平铺于1/2MS固体培养基上，置于组培室中培养2周，将小苗移出到生根培养基中生长20 d用于侵染。大肠杆菌（Escherichia coli）Top10、根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌株、植物表达载体pROKⅡ为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。DAB显色试剂盒（Solarbio，北京）；配制NBT染液时需要用pH7.8的1mol/L磷酸缓冲液溶解NBT粉末；Evans Blue染液配制用双蒸水将Evans Blue的粉末溶解后备用。所有染液每100 mL均需中加入10 μL TritonX-100。

1.2 方法

1.2.1BpLTP4的克隆及表达载体的构建 利用拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/）查找耐盐LTP基因AT5G59310.1，采用同源序列比对的方法，在白桦基因组数据库（http：//birch.genomics.cn/）进行比对分析。将获得的序列利用NCBI blastX程序对其进行进一步功能注释。

根据CDS序列设计克隆引物，引物为LTPpROKⅡ-F：5'-CTCTAGAGGATCCCATGGCAAGGTTC GCAGCTTT-3'；LTP-pROKⅡ-R：5'-TCGAGCTCGGT ACCCTTACATCATCATCATCATCATCTTGGAACAAT CGGTAG-3'（金唯智，江苏）。

以白桦组培苗为材料，液氮充分研磨后，用植物总RNA提取试剂盒（Bioteke Corporation）提取白桦的总RNA；利用反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit）合成第一链cDNA。以cDNA为模板通过PCR扩增目标基因。经1%琼脂糖/EB凝胶电泳检测后利用胶回收试剂盒进行胶回收（OMEGA）。利用In-Fusion高效连接酶（In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit）将BpLTP4片段与pROKⅡ线性载体50℃连接。将重组载体转入Top10大肠杆菌感受态中，挑取单克隆菌落进行菌液PCR检验，将阳性克隆的菌液进行DNA测序验证（擎科，广州），测序序列经比对正确后为pROKⅡ-LTP重组载体。

1.2.2BpLTP4的生物信息学分析 利用ExPASy提供的ProtScale对LTP4进行亲水性分析；利用TMHMM Server v.2.0预测LTP4的跨膜区域；利用在线软件SOPMA和SWISS-MODEL分别预测LTP4蛋白的二级结构和三级结构；利用BioEdit软件对LTP4蛋白进行多序列比对分析；利用MEAG软件采用 Neighbor-Joining法对LTP4蛋白及查阅相关文献获得的其他物种耐盐LTP基因进行进化树分析。

1.2.3 盐胁迫下BpLTP4表达模式分析 利用荧光定量PCR法对盐胁迫下LTP4进行表达量分析，以4周龄的东北林业大学野生型土培白桦幼苗为试验材料。用200 mmol/L NaCl浇灌处理幼苗（0、6、12、24和48 h），用植物总RNA提取试剂盒（Bioteke Corporation）提取白桦的总RNA；利用反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）合成第一链cDNA。根据BpLTP4序列设计定量引物LTP4 F：5'-ATGGCAAGGTTCGCAGCTTT-3'，LTP4 R：5'-TATTCGAAGCAGCATCGAGT-3'，选择beta-tubulin和ubiquitin（GenBank Ac. Num.：HO112154和FG065618）作为内参基因［15］。在Bio-Rad Hercules.CA.USA.上完成qRT-PCR反应。用2-ΔΔCT方法进行相对表达量分析［16］。

1.2.4 植物工程菌制备 将测序鉴定成功的BpLTP4-pROKⅡ的大肠杆菌用小剂量质粒提取试剂盒（OMEGA）提取质粒后用液氮法将重组质粒转入EHA105农杆菌感受态细胞中，均匀涂布于含有25 mg/L Rif和50 mg/L Kana的固体LB培养基上，倒置于28℃的恒温培养箱中培养2-3 d。挑取单菌落于LB液体培养基（25 mg/L Rif 和 50 mg/L Kana）培养，并做PCR鉴定。

1.2.5 叶盘法转化烟草 吸取800 μL过夜活化OD600的阳性克隆农杆菌于100 mL LB液体培养基（50 mg/L Kana，50 mg/L GM，50 mg/L Rif）中，28℃震荡培养菌液的OD600于0.4-0.6。将组培的烟草叶片无菌操作切成2-3 cm的小块平铺于1/2MS固体培养基上备用，将菌液4℃离心10 min后用MS液体培养基重悬加入100 μmol/L AS，将切好的叶片置于重悬液中轻摇8 min；取出烟草叶片，滤纸吸去叶片上多余的菌液，置于分化培养基上暗培养2 d；将叶片取出换至选择培养基中16 h光照/8 h暗培至叶片分化出抗性芽后，将其转移至生根培养基（50 mg/L Kana）中培养。

1.2.6 转基因烟草耐盐功能分析

1.2.6.1 盐胁迫下发芽率测定 将野生型烟草种子和BpLTP4转基因烟草种子等量（30±3个）的点在不含NaCl和含有150 mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基平板上，培养10-12 d，观察生长情况，计算烟草种子发芽率。采用SPSS18.0对发芽率进行显著性差异分析。

1.2.6.2 盐胁迫下根长性状分析 将野生型烟草种子和BpLTP4转基因烟草种子在不含NaCl的培养基上培养10 d后将其分别转移至含有0和150 mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基平板上，培养15 d后，将其平铺在培养基上测量其根长并进行数据统计分析。采用SPSS18.0对发芽率进行显著性差异分析。

1.2.6.3 盐胁迫下组织化学染色分析 将野生型烟草种子和BpLTP4转基因烟草种子在不含NaCl的培养基上培养10 d后将其转移至土中继续培养15 d，而后分别对WT和转基因植株进行150 mmol/L NaCl浇灌胁迫处理与水浇灌对照处理5 d，分别剪取胁迫处理和对照处理的烟草叶片进行DAB、NBT及Evans blue化学染色。

1.2.7 盐胁迫下生理生化指标测定 将WT烟草种子和BpLTP4转基因烟草种子在不含NaCl的培养基上培养10 d后转移至土中继续培养15 d，而后分别对WT和转基因植株进行150 mmol/L NaCl浇灌胁迫处理与水浇灌对照处理35 d，取胁迫处理与对照处理的植株用液氮研磨后测定其POD、SOD活性（建成生物工程研究所试剂盒，南京）。采用SPSS18.0对POD、SOD酶活活性进行显著性差异分析。

2 结果

2.1 BpLTP4的克隆

在白桦基因组中通过同源序列比对及保守结构域分析筛选LTP。鉴定出一条白桦LTP，该基因CDS全长357 bp，氨基酸序列全长118 aa。将其命名为BpLTP4。利用RT-PCR克隆目的基因获得长度为357 bp的基因目的片段（图1）。

2.2 BpLTP4的生物信息学分析

BpLTP4的氨基酸亲水性预测值在0.5-2.5之间，为疏水性蛋白。BpLTP4蛋白的潜在跨膜区包含1-30位氨基酸，其中1-6位的氨基酸在膜内，7-29位的氨基酸是跨膜的螺旋结构，第30位后的氨基酸在细胞膜外发挥功能，因此推测BpLTP4存在一个潜在的跨膜区。二级结构预测结果显示，BpLTP4蛋白主要由α螺旋及不规则卷曲构成，并含有少量的延伸链和β转角；三级结构预测结果显示，该蛋白由α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲相互盘绕、折叠三维构象（图2）。多序列比对结果显示BpLTP4蛋白在保守位置带有8个Cys残基，是LTP家族基因重要结构［17］（图3）。进化树分析结果显示BpLTP4蛋白与耐盐蛋白ThLTP（ACM78614.1）［18］、TaLTP（EF342573.1）［19］、AtLTP3（AT5G59320.1）和AtLTP4（AT5G59310.1）［13］同源性高，因此，推测BpLTP4具有耐盐功能（图4）。

图1 BpLTP4的PCR扩增

图2 BpLTP4的生物信息学分析

2.3 盐胁迫下BpLTP4表达模式分析

利用qRT-PCR定量分析结果（图5）显示BpLTP4在胁迫处理6 h，表现出一个低度的下调表达，在12和24 h时随着胁迫时间变长BpLTP4的表达量开始逐步上升，在胁迫处理48 h时高度诱导表达，说明BpLTP4参与盐胁迫应答。

2.4 BpLTP4转基因烟草的鉴定

通过农杆菌阶段的叶盘转化法，获得CaMV 35S Pronoter驱动BpLTP4表达的转基因烟草抗性株系。提取转基因和野生型烟草DNA，用pROKⅡ载体引物对其进行PCR检测，结果（图6）显示BpLTP4成功转入烟草，获得3个烟草转基因株系。

2.5 盐胁迫下发芽率分析

为分析盐胁迫条件下转基因烟草的耐盐性，首先对其进行NaCl处理下的发芽率分析（图7），WT和3个转基因株系在不含NaCl的培养基上种子发芽率为100%，在含有150 mmol/L NaCl的培养基上培养时，发芽率均明显下降，WT的发芽率仅为11.42%，转基因株系的发芽率分别为64.7%、54.54%和51.51%，是WT的5.6倍、4.7倍和4.5倍。说明转基因株系种子较WT耐盐性高。

图3 LTP4蛋白与其他LTP抗性基因蛋白序列比对分析

图4 BpLTP4蛋白与LTP其他耐盐蛋白系统进化分析

图5 NaCl胁迫处理后白桦BpLTP4表达量分析

图6 BpLTP4转基因烟草DNA分子检测

图7 NaCl胁迫处理转BpLTP4烟草种子发芽情况分析

2.6 盐胁迫下生长性状分析

为进一步分析其生长性状的差异，将胁迫条件下生长至15 d的烟草平铺在培养基上观察其生长状态，测量其根长并进行数据统计分析（图8），在未胁迫处理条件下，对照和转基因株系根长及生长性状差别不明显。在150 mmol/L NaCl胁迫条件下，WT叶片出现明显盐害性状，叶片变黄，而转基因株系叶片变色不明显。转基因株系根长是WT的1.099倍、1.233倍和1.242倍。说明BpLTP4提高了转基因株系的耐盐性。

2.7 盐胁迫下组织化学染色分析

为进一步分析其提高转基因烟草耐盐性的作用机制，剪取胁迫处理和未胁迫处理的烟草叶片进行组织化学染色（图9），未胁迫处理时的染色情况一致，颜色均浅，胁迫处理后的WT与3个转基因株系的DAB染色均变深，说明胁迫处理后转基因烟草的H2O2的积累少于WT。NBT染色情况与DAB染色情况相似，说明转基因烟草清除O2-的能力较野生型烟草强，转基因株系更耐盐。在未胁迫处理时，WT和转基因株系的细胞完整性未受到影响，几乎不染色。而胁迫处理后，转基因株系的染色情况较WT染色浅，说明转基因株系细胞完整性高于WT。以上结果说明，BpLTP4异源转化烟草通过清除ROS来提高烟草的耐盐性。

图8 NaCl胁迫处理下转BpLTP4烟草表型分析

图9 NaCl胁迫下转BpLTP4烟草组织化学染色分析

2.8 盐胁迫下生理生化指标测定

取胁迫处理与未胁迫处理的植株经液氮充分研磨后测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性（图10）。未胁迫处理时，转基因株系与WT的POD、SOD活性差异不明显，在经过150 mmol/L NaCl胁迫处理后，3个转基因株系的POD活性分别是WT的1.27倍、1.28倍、1.22倍，SOD活性分别是WT的1.26倍、1.28倍、1.22倍。胁迫处理后WT和转基因株系的POD活性分别是是未胁迫处理的1.18倍、1.38倍、1.33倍、1.39倍。胁迫处理后WT和转基因株系的SOD活性分别是是未胁迫处理的1.02倍、1.18倍、1.16倍、1.18倍。说明转基因烟草在受到NaCl胁迫处理后通过提高植物体内POD和SOD保护酶的酶活性来提高转基因烟草的耐盐性。

图10 NaCl胁迫下转BpLTP4烟草生理指标分析

3 讨论

高等植物脂质转运蛋白是一种分子量为3-9 kD的小分子碱性蛋白［15］，占可溶性蛋白的4% 左右。BpLTP4的蛋白分子量为12.31 kD，分子量较棉花［20］、小麦［21］、拟南芥［20］等的LTP家族基因偏大。有研究显示LTP参与疏水性相互作用，其在细胞壁扩张中起着至关重要的作用［22］。本研究对BpLTP4的亲水性预测分析结果也显示该蛋白为疏水性蛋白。多序列比对结果显示BpLTP4在保守位置带有8个Cys残基是LTP家族基因特有结构。进一步对BpLTP蛋白的三级结构预测结果显示，该蛋白由α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲相互盘绕、折叠三维构象，该蛋白具有通过4对二硫键交联的4个α螺旋构成一个疏水腔结构［23］。进化树分析发现BpLTP4与其他物种的耐盐基因具有较高的同源性，因此，推测BpLTP4也具有耐盐性。Moraes等［24］用150 mmol/L NaCl胁迫处理水稻后，用qRT-PCR进行LTP表达量测定发现LTP7和LTP10参与盐胁迫应答。为了分析BpLTP4是否参与盐胁迫应答，本研究利用qRT-PCR分析BpLTP4在盐胁迫下的表达模式，发现BpLTP4的表达受盐胁迫诱导，进一步说明其可能参与植物的耐盐调控。

将基因稳定转化至模式植物中是研究该基因功能最直接有效的方法，通过研究转基因植物的性状或功能的变化来研究该基因的功能［25］。李健［18］将ThLTP转入山新杨中，用不同浓度NaCI胁迫处理组培苗，统计度量分化率、生长量、生根率、盐害指数等指标，发现转ThLTP山新杨株系提高了植株的耐盐能力。Xu等［26］用高盐胁迫处理转NtLTP4烟草进行耐盐功能分析，通过组织化学染色及生理生化指标测定发现NtLTP4在高盐条件下不仅抑制了植物体内ROS的产生，而且参与了ROS的清除过程，因此提高了转基因植株的抗氧化能力。为分析BpLTP4是否能够提高植物耐盐性，具有耐盐功能，本研究将BpLTP4利用农杆菌介导叶盘转化法转入烟草，以发芽率、根长、及生理生化指标测定作为耐盐性的度量指标，对BpLTP4烟草转基因株系的耐盐性进行初步分析。发芽率和根长指标均说明BpLTP4能够提高烟草的耐盐性。进一步利用DAB、NBT和Evans blue染色来判断转BpLTP4基因烟草株系与野生型株系在NaCl胁迫处理后细胞内的H2O2、O2-的积累量和细胞完整性。发现转基因株系染色情况较WT染色浅，说明在NaCl胁迫处理后转基因株系H2O2、O2-的积累量较野生型少，NaCl胁迫处理后转基因株系细胞完整性更好。本研究进而测定了NaCl胁迫处理后的转BpLTP4烟草株系与野生型株系的POD、SOD酶活活性，结果发现BpLTP4在转基因烟草中能够通过提高保护酶活性来清除ROS，从而提高转基因烟草耐盐性。

4 结论

克隆获得BpLTP4，其CDS全长为357 bp。BpLTP4为疏水性蛋白，且存在一个潜在的跨膜区。该蛋白是有α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲相互盘绕、折叠成三维构象。具有LTP家族特有的8个Cys残基结构特点，且与耐盐基因同源性高。获得3个BpLTP4过表达烟草转基因株系。BpLTP4转基因株系在150 mmol/L NaCl的培养基中发芽率较野生型高；转基因株系幼苗生长状态较野生型健康，且根长较野生型长；胁迫处理后的转基因株系的组织化学染色较野生型浅，POD、SOD活性明显增高。因此BpLTP4通过提高保护酶活性清除ROS来提高转基因烟草的耐盐性，具有一定的耐盐性。