储存时间、铜源及其添加水平对脂溶性维生素稳定性的影响

孔凡科 ，郭吉原，杨 青，周桂莲，张 敏，燕 磊,3,4，孙春华

（1.山东新希望六和集团有限公司，山东青岛 266100；2.畜禽饲料与畜禽产品质量安全控制四川省重点实验室，四川成都 610101；3.农业农村部饲料及畜禽产品质量安全控制重点实验室，四川成都 610101；4.潍坊新希望六和饲料科技有限公司，山东潍坊 261100）

铜作为动物体内重要的微量元素，对促进动物的生理代谢[1]及增强动物机体免疫力[2]具有非常重要的作用，是动物饲料中不可缺少的重要营养成分。维生素则是维持动物繁殖性能及健康生长的关键养分，动物体内缺乏维生素会导致维生素缺乏症[3]。影响复合预混合饲料中维生素稳定性的因素有多种，其中微量元素对维生素的稳定性具有较强的破坏作用[4]。目前饲料厂常用的铜源主要有硫酸铜、碱式氯化铜。段俊红等[5]研究表明，微量元素的添加量与维生素A 的损失率呈显著正相关。赵金伟等[6]研究发现，铜、铁、锰、锌4 种微量元素对预混料中维生素A 的破坏程度为锰＜锌＜铁＜铜。可见铜元素对饲料中脂溶性维生素的稳定性有重要影响。国内外的相关研究主要从多种微量元素的组合作用及动物养殖试验方面考察饲料中微量元素对脂溶性维生素的影响。尚未发现只针对铜源与脂溶性维生素相互作用方面的研究。本试验选用五水硫酸铜和碱式氯化铜作为铜源，以磷酸氢钙作为载体，分别添加同等量的维生素A、维生素D3、维生素E，研究不同铜源在不同处理时间和不同添加水平条件下对维生素A、维生素D3、维生素E 稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 脂溶性维生素 维生素A 乙酸酯微粒含量为50 万IU/g；维生素D3乙酸酯微粒含量为50 万IU/g；维生素E 乙酸酯微粒含量为50%。

1.2 试验铜源及载体 五水硫酸铜（S）含量为25%，碱式氯化铜（J）含量为58%。本试验所用载体为磷酸氢钙。

1.3 复合添加剂组成 复合添加剂中铜的含量参照0.2%猪用微量元素预混料（铜含量9%）为基准配制，共设4 个添加水平，铜含量分别为4.5%、9%、13.5%、18%；复合添加剂中维生素A、维生素D3、维生素E含量参照0.3%猪用维生素预混料中的要求配制，维生素A 为3 167 000 IU/kg、维生素D3为733 000 IU/kg、维生素E 为16 667 mg/kg。复合添加剂成分组成见表1。

1.3 试验温度条件及试验分组 控制室温在（25±2）℃，湿度控制在50%左右，将样品避光密封保存。以磷酸氢钙为载体，分别添加3 167 000 IU/kg 维生素A、733 000 IU/kg维生素D3、16 667 mg/kg 维生素E，对照组不添加铜源，试验组分别添加4.5%、9%、13.5%、18% 五水硫酸铜或碱式氯化铜，每个处理组3 个重复，每份处理样品约为55 g。储存处理时间为8 周。

1.4 试剂及仪器设备

1.4.1 维生素标准品及试剂 维生素A 乙酸酯标准品、维生素D3乙酸酯标准品均购自美国USP，产品标识含量分别为33.4 mg/g、99.6%。维生素E 乙酸酯标准品购自Sigma，产品标识含量为98.9%。无水甲醇购自德国Merck，色谱纯。

1.4.2 脂溶性维生素混合标准工作溶液 以甲醇为溶剂，采用逐级稀释法分别将维生素配制成7 个不同浓度的标准工作溶液，即维生素A、维生素D3浓度分别为0、5、10、20、50、100、200 IU/mL，维生素E 浓度为0、5、10、20、50、100、200 μg/mL。

1.4.3 仪器与设备 超高效液相色谱仪（Waters UPLC H-Class）带PDA 检测器（e-λ PDA），恒温培养箱（SANYO MIR-262），数控超声波清洗器（KQ-500DE），三维混合机（SYH-5）。

1.4.4 色谱条件 色谱柱：BEH-C18 色谱柱，内经2.1 mm，柱长100 mm，粒径1.7 μm。流动相：98%甲醇水溶液。流速：0.3 mL/min。进样量：2 μL。检测波长：维生素A，326 nm；维生素D3，264 nm；维生素E，285 nm。

1.5 试验步骤

1.5.1 试液的制备 试液的制备参照国家标准方法进行[7-9]：准确称取处理好的试验样品1.0 g（精确至0.000 2 g）于100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇60 mL，轻轻摇匀，将容量瓶放于超声波清洗器中，在60℃条件下，超声提取30 min，取出，将容量瓶放于通风柜中冷却至室温，然后用甲醇定容至刻度，摇匀，静置，取上清液1.00 mL于5 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，取1 mL 稀释液，过0.22 μm 有机系微孔滤膜于棕色进样瓶中，上机待测。

1.5.2 上机检测 将配制好的标准工作溶液和制备好的试液按照色谱条件1.4 上机测定。

1.6 结果计算

1.6.1 脂溶性维生素计算公式 样品中的脂溶性维生素（维生素A/维生素D3/维生素E）以质量分数（KIU/kg或mg/kg）表示，计算公式如下：

式中，X为样品中脂溶性维生素（维生素A/维生素D3/维生素E）的含量，kIU/kg（mg/kg）；C为根据标准工作曲线计算得到的试液中脂溶性维生素（维生素A/维生素D3/ 维生素E）的含量，IU/mL（μg/mL ）；m为样品质量（g）；V为样品稀释体积（mL）。

1.6.2 损失率计算公式 样品中的脂溶性维生素（维生素A/维生素D3/维生素E）损失率的计算公式如下：

式中，Xi为相同铜源相同铜添加水平下第i个处理水平的脂溶性维生素（维生素A/维生素D3/维生素E）的检测结果，kIU/kg（mg/kg）；X1为脂溶性维生素（维生素A/维生素D3/维生素E）的理论添加值，kIU/kg（mg/kg）。

1.7 数据处理 每个处理组不同处理时间的样品平行测定3 次，结果以平均值±标准误表示，结果保留3 位有效数字，采用SPSS20.0 软件进行统计分析，Duncan's法进行极差检验。

2 结果

2.1 色谱图及相关系数 由图1 可以看出，全反式维生素A、顺式维生素A、维生素D3、维生素E 分离度良好，峰型对称、尖锐，符合检测要求。由表2 可以看出，维生素A、维生素D3、维生素E 的标准工作曲线相关系数均在0.995 以上，满足标准规范的各项要求。

表1 复合添加剂成分组成 g

图1 维生素A、D3、E 的检测结果色谱图

表2 标准工作曲线及相关系数

2.2 主效应分析 由表3 可知，铜源对维生素A 的损失率影响不显著，对维生素D3、维生素E 的损失率影响显著。铜源添加水平及处理时间对维生素A、维生素D3、维生素E 的损失率影响显著。

2.2.1 处理时间对脂溶性维生素的影响 由表3 可知，常温处理1 周，维生素A 的损失率与对照组没有显著差异，维生素D3和维生素E 的损失率较对照组显著增加。随着处理时间的延长，维生素A、维生素D3、维生素E 的损失率先快速上升、然后下降，而后稳步增加，维生素A 和维生素E 的损失率在第7 周达到峰值，分别为17.35%、12.85%，维生素D3的损失率在第8 周达到峰值，为45.19%。

2.2.2 铜源及其添加水平对脂溶性维生素的影响 如表3 所示，铜源对维生素A 的损失率影响不显著，铜源对维生素D3、维生素E 影响显著，五水硫酸铜对维生素D3的破坏作用显著大于碱式氯化铜，碱式氯化铜对维生素E 的破坏作用极显著大于五水硫酸铜。如表3 所示，常温条件下，添加铜能够显著增加维生素A 的损失率，但铜添加量在4.5%～18% 时，铜对维生素A 的损失率没有显著影响。铜添加水平对维生素D3的损失率有显著影响，铜添加量较低时（≤4.5%），维生素D3的损失率与对照组差异不显著，随着添加量的增加，维生素D3的损失率显著增加。铜添加水平对维生素E 的损失率有显著影响，维生素E 的损失率随着铜添加量增加呈先增加后降低的趋势。

表3 处理时间、铜源及其添加水平对脂溶性维生素A、D3、E 的影响 %

3 讨 论

3.1 处理时间对脂溶性维生素的影响 国内外研究表明储存时间是影响维生素稳定性的重要因素。赵金伟等[6]研究表明，复合预混合饲料存储60 d，维生素A 的损失率能达到24.86%～64.78%。周俊华等[10]曾报道，储存120 d 后，添加无机微量元素的预混料中维生素A 每月平均损耗约9%。本试验结果显示，处理时间能显著增加维生素A、维生素D3、维生素E 的损失率，维生素A 和维生素E 的损失率在第7 周达到峰值，分别为17.35%、12.85%，维生素D3的损失率在第8 周达到峰值，为45.19%，未见明显减缓的迹象。因此，复合预混合饲料在常温条件下保存时间不宜超过6 周。在常温条件下维生素E 的稳定性最好，维生素A 的稳定性次之，维生素D3的稳定性最差。

3.2 铜源及其添加量对脂溶性维生素的影响

3.2.1 铜源对脂溶性维生素的破坏作用 氯化铜、硫酸铜、氢氧化铜、碱式氯化铜为常见固体催化剂，在特定条件下能够催化烯烃发生氧化还原反应[11]。铜离子能够催化产生活性氧，活性氧能引发链式反应，从而对维生素造成破坏[12]。维生素A 乙酸酯是由视黄醇和乙酸通过酯化反应生成，视黄醇是一种类异戊二烯分子，是由异戊二烯构件分子生物合成的[13]，在空气中易被氧化，高温高湿及碱性条件下，维生素A 在碱式氯化铜中残留的氯化铜和氢氧化铜的催化下，会加速维生素的变性与失活。维生素D3是甾族化合物，为己三烯衍生物，又称胆钙化醇[14]，有3 个双键，性质较活跃，容易受到铜盐和碱的催化作用而失活。维生素E 又称生育酚，在化学结构上为苯并二氢吡喃的衍生物，以α-生育酚活性最高。在高温高湿及碱性条件下，苯羟基易发生取代反应，而使其失活。林月霞等[15]报道，饲料中碱式氯化铜源对维生素E 稳定性的影响明显优于硫酸铜源。本试验结果表明，铜源对维生素A 的损失率影响不显著，对维生素D3、维生素E 影响显著，五水硫酸铜对维生素D3的破坏作用显著大于碱式氯化铜，损失率偏高约4.7%，碱式氯化铜对维生素E 的破坏作用显著大于五水硫酸铜，损失率偏高约2.1%。造成这种现象的原因可能是：碱式氯化铜及其中含有的少量氯化铜、氢氧化铜及铵盐等对维生素E 的催化作用要强于五水硫酸铜，五水硫酸铜对维生素D3的催化作用要强于碱式氯化铜。

因此，在常温地区使用五水硫酸铜生产复合预混合饲料对维生素E 较为稳定，使用碱式氯化铜生产复合预混合饲料对维生素D3较为稳定，营养师可以根据饲料产品的实际情况选择铜源进行饲料配方设计。

3.2.3 铜源添加水平对脂溶性维生素的影响 段俊红等[5]研究结果表明，碱式碳酸铜的添加量对维生素A 的损失率影响极为显著。孙海霞[16]研究表明，提高铜添加量对维生素A 的损失率影响不显著。本试验结果表明，常温条件下，添加铜源能够显著增加维生素A、维生素D3及维生素E 的损失率，随着铜添加量的增加（≥4.5%）维生素A 的损失率没有显著变化，维生素D3的损失率随着铜添加量的增加显著增加，维生素E 的损失率随着添加量的增加呈先增加后降低的趋势。因此，在复合预混合饲料中要将脂溶性维生素D3的损失率控制在20%以内，铜的添加量建议控制在4.5%以下。

4 结 论

本试验条件下，随着存储时间延长，维生素A、维生素D3、维生素E 的损失率显著增加，复合预混合饲料在常温条件下保存时间不宜超过6 周；铜源对维生素A的损失率影响不显著，对维生素D3、维生素E 影响显著，在低温干燥的地区使用五水硫酸铜生产复合预混合饲料对维生素E 较为稳定，使用碱式氯化铜生产复合预混合饲料对维生素D3较为稳定；常温条件下，添加铜源能够显著增加维生素A、维生素D3及维生素E 损失率，复合预混合饲料中铜的添加量应控制在4.5%以内。