银杏叶片对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用研究

杭州市中医院 浙江 杭州 310007

在缺血基础上恢复血流后组织损伤加重，甚至发生不可逆行损伤的现象称为缺血再灌注损伤，亦称为心肌细胞缺氧复氧损伤，主要由能量代谢、氧化应激、钙离子超载等因素所致。自20世纪60年代，德国科学家发现银杏叶中含有治疗心脑血管疾病的药效成分以来，越来越多的研究表明，银杏叶提取物在心脑血管疾病的治疗中具有很好的药理活性[1-2]。银杏叶片是临床常用的心脑血管保护制剂，具有活血化瘀通络之功效，本文在细胞水平研究其对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用，以评估其在临床心血管急症中的治疗价值。

1 材料与方法

1.1 材料：Annexin V-FITC/PI检测试剂盒（联科生物），PBS缓冲液（吉诺生物医药技术有限公司）。流式细胞仪（BD，FACSCanto）；酶标仪（赛默飞，Multiskan FC）。心肌细胞（H9C2细胞）购自中国科学院上海细胞库，用含有10%热灭活FBS的高糖DMEM培养基置37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2 试验方法：分述如下。

1.2.1 细胞存活率和线粒体氧呼吸率实验：H9C2细胞接种于96孔板，10%FBS高糖培养基培养（Gibco）24hrs后，加入含有大银杏叶片（稀释1/50，1/100,1/200）无糖无血清培养液（Gibco），放入缺氧小室和缺氧箱（95%N2/5%CO2）培养22h后全培养基复氧2h，同时设正常对照和模型组。采用MTT法测定细胞存活率；采用液相氧呼吸仪测定细胞氧呼吸率。

1.2.2 细胞凋亡监测：H9C2细胞接种于6孔板，10%FBS高糖培养基培养（Gibco）24hrs后，加入含有大银杏叶片（稀释1/50，1/100,1/200）无糖无血清培养液（Gibco），放入缺氧小室和缺氧箱（95%N2/5%CO2）培养22 h后全培养基复氧2h，同时设正常对照和模型组。复氧后收集细胞并用预冷的PBS润洗两遍，再加入流式缓冲液重悬，然后加入Annexin V-FITC和PI两种试剂在37℃下避光孵育15分钟后染色10分钟，再采用流式细胞仪检测细胞荧光。

1.3 统计学处理：采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据统计和作图，所有数据均以(Mean±SD)表示，组间比较采用One-way ANOVA分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银杏叶片增加缺氧复氧损伤心肌细胞的存活率及线粒体氧消耗量：MTT检测结果显示，缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率下降到60%左右，加入银杏叶片后能显著提升细胞存活率（P＜0.05），而且在1/50～1/200范围内，随着银杏叶片浓度升高，心肌细胞存活率有升高趋势。见图1。

线粒体氧呼吸率试验结果显示，缺氧复氧损伤后心肌细胞线粒体氧消耗量显著下降，银杏叶1/50剂量组显著提升缺氧复氧损伤后心肌细胞线粒体氧消耗量（P＜0.05）。见图2。

图1 银杏叶片增加缺氧复氧损伤心肌细胞的存活率(n=6)

图2 银杏叶片增加缺氧复氧损伤心肌细胞线粒体氧消耗量(n=6)

2.2 银杏叶片抑制缺氧复氧损伤心肌细胞凋亡：流式细胞检测凋亡结果显示，银杏叶1/50、1/100剂量组显著抑制缺氧复氧损伤心肌细胞凋亡（P＜0.05）。见图3。

图3 银杏叶片抑制缺氧复氧损伤心肌细胞凋亡(n=3)

3 讨论

随着冠状动脉搭桥术、溶栓术等急性心肌梗死治疗技术的推广，心肌细胞缺血再灌注损伤已经成为影响急性心肌梗死患者治疗效果与预后的重要研究指标。心肌缺血再灌注损伤的主要原因有能量代谢障碍、过氧化损伤、钙超载等，其中氧自由基生成导致的过氧化损伤是造成心肌细胞缺血再灌注损伤的重要环节[3,4]。因此，急性心肌梗死治疗中除了尽快恢复缺血组织的血流灌注外，应重点考虑对缺血时间较长的心肌组织进行保护，以减少再灌注导致的心肌细胞凋亡。

基础研究结果显示，银杏叶活性成分在心血管疾病的治疗中表现出了很好的疗效[5-6]，Wang Z[7]等人通过心肌梗死模型的代谢组学研究结果显示，银杏叶提取物可调节能量代谢，具有抗炎、抗氧化、降脂等多种功效；Zhang[8]等人对银杏叶提取物EGb761进行观察，发现其能通过调节ATM通路和细胞凋亡来保护缺氧/复氧损伤的微血管内皮细胞。本次研究以已上市的药物银杏叶片为对象，采用缺氧复氧H9C2心肌细胞为模型。结果显示，加入银杏叶片保护后再对缺氧心肌细胞进行复氧，MTT实验检测结果显示心肌细胞存活率显著升高，而流式细胞检测结果则显示心肌细胞凋亡率显著下降，可见，银杏叶片能有效保护心肌细胞，抑制心肌细胞缺氧复氧后死亡。

心肌细胞缺氧复氧后会导致线粒体内钙超载及过氧化应激，最终导致线粒体膜破裂，线粒体膜间的促凋亡因子大量释放，并最终激活心肌细胞凋亡通路，促使大量心肌细胞损伤[9]。我们的线粒体氧呼吸率试验结果显示，缺氧复氧损伤后心肌细胞线粒体氧消耗量显著下降，银杏叶片则可显著提升缺氧复氧损伤后心肌细胞线粒体氧消耗量，说明银杏叶片对缺氧复氧心肌细胞的线粒体具有保护作用，其机制可能通过保护线粒体来抑制心肌细胞凋亡。

总之，我们通过初步研究证实银杏叶片对缺氧复氧心肌细胞具有保护作用，能有效抑制缺氧复氧后心肌细胞凋亡，其作用机制可能与其对线粒体的保护作用有关。至于银杏叶片对缺氧复氧心肌细胞保护的具体分子机制及动物水平验证，还有待进一步研究。