胰腺肿瘤的基础转化研究模型

郭世伟

海军军医大学附属长海医院胰腺肝胆外科，上海 200433

【提要】 在多种癌症治疗取得突破的今天，胰腺癌治疗药物的研发仍举步维艰，缺少能反映肿瘤细胞生物学特性和模拟其复杂微环境的模型是导致从基础到临床转化研发失败的重要原因。随着类器官、人源肿瘤异种移植和人源化小鼠等技术的出现，使个体化精准研究肿瘤异质性、高度模拟包含间质细胞和免疫细胞的肿瘤微环境成为可能。利用这些新技术开展胰腺癌的基础和转化研究可以弥补既往研究手段的不足，有可能建立适用于胰腺癌研究的精准模型，推动胰腺癌治疗药物的研发，改善胰腺癌的疗效。

2020年1月8日《CA Cancer Journal for Clinicians》[1]发布了美国癌症统计的最新数据，美国癌症病死率出现历史上大幅年度下降(2.2%)，是自1930年以来下降幅度最大的一次，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌四大常见癌症病死率稳步下降，黑色素瘤病死率下降幅度甚至达到了7%。究其原因，在危险因素防控的基础上有效治疗药物的出现是其决定因素。黑色素瘤治疗的突破要归功于新获批的多种疗法，包括免疫检查点抑制剂Yervoy (ipilimumab)、Opdivo (nivolumab)、Keytruda (pembrolizumab) ，靶向疗法BRAF抑制剂Zelboraf(vemurafenib)等[2-4]。然而上述突破性疗法，包括靶向治疗、免疫检查点抑制剂、细胞治疗和质子重离子等在胰腺癌的临床治疗试验中均以失败告终[5]；另一方面，大量通过传统基础研究模型筛选的药物往往在临床前动物模型验证中即以失败告终[6]。这些都导致了胰腺癌无药可用，无法可医，死亡人数接近发病人数，被认为是恶性程度最高的肿瘤。因此，探索究竟是哪些因素导致了目前治疗的失败成为胰腺肿瘤基础和转化研究的重要方向。

一、胰腺肿瘤复杂的发病机制决定了现有研究策略的失效

目前研究认为，胰腺肿瘤的发病机制明显区别于其他肿瘤，导致其恶性程度高的特性主要集中于以下三个方面。

1．肿瘤细胞来源多样，恶变机制复杂：目前经典的胰腺癌发生模型认为肿瘤来源于导管上皮，早期病变为胰腺上皮内肿瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)，根据病变不典型增生程度可逐级分为扁平黏液上皮(PanIN-1A)到原位癌(PanIN-3)[7]，即胰腺导管上皮细胞从正常演变到PanIN直至浸润性癌的过程，同时伴随K-ras、CDKN2A、SMAD4、TP53基因的突变。癌基因K-ras突变被认为是早期事件(PanIN-1A阶段突变率35%， PanIN-1B 43% ，PanlN-3 100%)，CDKN2A突变出现在PanIN-2，而SMAD4、TP53基因失活出现在后期[8-9]。然而临床研究的结论却与之不符。Guerra等[10]和Ji等[ 11]发现胰腺癌可来源于腺泡细胞，Ferreira等[12]证明通过癌基因AGR2可区分胰腺肿瘤的细胞来源，大部分胰腺癌来源于腺泡细胞发生导管组织转化(acinar-ductal metaplasia, ADM)。而临床上90%的PDAC患者可检测出K-ras突变，只有60%的患者可检出TP53突变[13]。Notta等[14]发现60%的胰腺癌细胞在有丝分裂过程中曾经出现过染色体碎裂(chromothripsis)，导致肿瘤进展的基因突变不是依次发生而是同时产生，从而颠覆性认为胰腺癌的发生过程可能不是一个渐进的过程，大量的基因变异可以通过一次或少数几次有丝分裂过程中的错误而爆炸性地产生，从而造成胰腺癌高度恶性，最终导致不同胰腺肿瘤间存在极大的异质性，即生物行为差异明显。以上假说使得胰腺癌分子分型研究在经历多篇《Nature》文章论证后又回到了基于RNA表达分型的两分法上[15-17]，难以指导目前的临床个体化治疗。目前临床获益的只是具有遗传BRCA突变，且铂类化疗无进展的近1%的患者[18]。因此，在针对K-ras和TP53突变的有效治疗出现前，类似肺癌以针对单一驱动基因治疗肿瘤的方案在胰腺癌上难以突破。

2．间质成分大量增生，作用因时而异：大量的间质增生是胰腺癌区别于其他实体肿瘤的另一大特征。在经典的胰腺癌病理形态中肿瘤细胞只占20%～50%，而剩余的由增生的间质细胞及其分泌的基质组成[19]。这些间质使得肿瘤局部压力增高，缺血缺氧，导致肿瘤局部微环境复杂，化疗药物很难通过，是造成胰腺癌治疗效果差的重要原因。临床和基础研究都证实间质作用复杂，盲目去除间质反而会促进肿瘤进展。2014年两篇《Cancer Cell》杂志的研究分别证明间质成分可以限制而不是促进肿瘤细胞生长，删除肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast, CAF，SMA+)会减轻纤维化导致的针对肿瘤细胞的免疫抑制，并加速肿瘤进展[20-21]。可有效抑制胰腺星状细胞激活的Hedgehog通路抑制剂IPI-926(saridegib)的Ⅱ期临床研究(NCTO1130142)结果显示，IPI-926与吉西他滨联用后患者生存期反而更短，不良反应发生率更高[22]。用KPGC模型小鼠进行的透明质酸酶(PEGPH20)研究在联合AG化疗方案取得阳性结果后[23]，联合FOLFIRINOX方案治疗却导致了患者更短的生存期[24]。相反，临床取得成功的AG化疗方案曾被归因于可以和SPARC蛋白结合清除纤维间质并增加吉西他滨的灌注，然而最近的研究却发现SPARC蛋白的表达并不能预测AG方案的疗效，动物实验也证明和SPARC蛋白表达无关，提示AG方案的有效与“去间质化”并不直接相关[25]。以上结果都说明胰腺肿瘤中CAF是一个复杂的、有多种细胞来源的混合体，部分成分(SMA+)可能主要起抑制肿瘤作用[26]，部分成分(FAP+、FAK+、POSTN+)可能起促进肿瘤作用，在不同阶段、不同药物治疗过程中扮演的角色也不同[27]。因此，在进一步明确各种来源的CAF在胰腺肿瘤发生发展过程中具体作用之前，盲目针对间质的治疗可能会产生临床难以解释的结论，干扰胰腺癌治疗药物的研究。

3．免疫逃逸机制不明，常规阻断无效：虽然PDAC通常被研究者归为“冷肿瘤”，但如果除去大量增生的间质区域，在肿瘤细胞周围可以观察到各种免疫细胞的大量浸润[28]，其中肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)比例偏少，而与免疫抑制相关的巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TANs)、骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells， MDSCs)、调节性 T细胞(regulatory T cells，Tregs)、调节性 B 细胞(regulatory B cells，Bregs)较多[29]。这些细胞的免疫抑制机制主要包括上调抗肿瘤免疫细胞的免疫抑制受体，如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic tlymphocyte-associateda ntigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受体1(programmed death 1, PD-1)表达；分泌免疫抑制性可溶性介质，如 IL-10、TGF-β;抑制免疫细胞对必需代谢底物(如色氨酸、精氨酸)的利用等[30]。然而，最新研究发现这些免疫抑制细胞在胰腺癌中发挥的功能却很复杂。《Cancer Discovery》的研究发现，单纯Treg细胞的删除会改变肿瘤微环境并加速胰腺癌变[31]。临床研究也证实，可诱导Treg细胞凋亡并降低抑制性信号的CTLA-4单克隆抗体在胰腺癌患者中无效[32]。进一步研究发现，从癌前病变到晚期PDAC Treg水平逐步增加，癌旁小剂量 CTLA-4 单克隆抗体干预可有效减小肿瘤体积，而加大剂量后并未增加其抑瘤效果却增加了次级淋巴节Treg细胞的浸润，抵消了CTLA-4单克隆抗体抗肿瘤治疗的作用[33]。PD-1治疗只在微卫星不稳定的少数胰腺癌(<2%)中发挥作用[34]。同样被寄予厚望的针对IL-10的SEQUOIA在胰腺癌三期临床治疗中以失败告终[35]。这些结果都表明免疫微环境是一个复杂的整体，单纯抑制或拮抗某一类细胞无法解除整体免疫抑制。

因此，胰腺肿瘤需要一个复杂的三元n次方程来破解，肿瘤因素(a1,a2,a3……)+间质因素(b1,b2,b3……)+免疫因素(c1,c2,c3……)=高恶性生物学行为(Y)。

二、新研究模型的出现给肿瘤基础转化研究带来希望

既往抗肿瘤药物筛选模型已无法满足目前个体化肿瘤治疗的需要。2016年《Nature》杂志报道，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)宣布，被研究人员使用达25年的抗癌药物测试的癌细胞样本群(NCI-60)即将“退休”[36]。主要是因为这些细胞系多来自恶性程度较高的肿瘤或者转移灶，再加上历经几千代的培养，细胞的基因组和行为均发生了改变，难以反映临床肿瘤真实特性[37]。而取而代之，条件重编程细胞(conditional reprogramming cell，CRC)、类器官(organoid)和人源肿瘤异种移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)被认为是最有希望用于基础转化研究的3种技术。目前类器官和PDX技术已初步证明可行。

类器官是指在体外由组织细胞或多潜能干细胞培养得来的3D细胞团，具有自我更新、自我组织的能力，且有与原组织相似的功能[38]。类器官最初应用于对体外正常组织器官的培养，是传统体外2D培养与体内实验模型之间的桥梁。相比于传统的2D培养，类器官无论是在组成成分还是组织结构上都更贴近于来源组织；相比于体内实验模型，类器官可以应用各类药物和干预措施，研究组织器官发育及用于组织器官的移植和修复[39]。更重要的是，利用该技术构建的肿瘤细胞类器官可在体外真实立体模拟肿瘤和微环境中细胞的交互作用，真实反映药物的作用方式，甚至可以应用体内实验模型无法耐受的药物[40]。同时还可以对类器官应用基因工程技术(CRISPR-Cas9等)改造某些目的基因，从而研究该类基因对肿瘤细胞的作用[41]。这些特点都决定了通过肿瘤类器官进行药敏试验筛选候选药物，较细胞系等具有时间短、耗费低、结果准的优势，为肿瘤的基础和转化研究提供重要工具。

PDX是将人的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的肿瘤细胞生长所需活体环境而建成的动物模型[42]。该模型可以高度保留患者肿瘤的组织学特性、遗传学特征以及肿瘤特异性，同时也保留了一部分肿瘤微环境信息，包括成纤维细胞、细胞外基质，但缺少免疫细胞，因此能较好地反映肿瘤细胞及其微环境之间复杂的相互关系，使其在模拟人体肿瘤组织生长、转移、血管生成等方面具有独特优势[43]。早期由于免疫缺陷小鼠构建的不完全，加上复杂的操作步骤及高昂的成本， 使PDX应用受到极大限制。而在NCI提出转型后，全球已经加紧PDX库建设，NCI初期目标是建立1 000个PDX模型，并将这些小鼠体内培养的人类肿瘤细胞提供给研究者，其中还包括每个肿瘤的基因组和表达谱数据。EurOPDX就是由16个欧洲机构联合组成的PDX模型库，旨在建立和发展临床相关和标注的PDX网络库，据称已经拥有1 500个PDX模型[44]；美国的杰克逊实验室已经拥有超过450个PDX模型。冠科生物科技(Crown Bioscienc)、诺华等国际制药巨头也纷纷采用PDX模型进行抗肿瘤药物研究。目前很多不同肿瘤类型的临床试验已证明基于PDX模型与临床患者的药物反应相关性可达90%[45]。由于相同基因组特征的PDX模型可以被反复利用，使其在靶向药物研究中具有独特的优势。再加上PDX模型是目前认为在体外最接近真实肿瘤环境的动物模型，已经成为目前化疗和靶向药物研发的不二选择。

人源化肿瘤异种移植模型(humanized PDX cancer models, hu-PDX)是通过在NSG小鼠上重建人的免疫系统，然后再接种人的肿瘤，来评价肿瘤免疫治疗效果的模型[46]。用于建立PDX模型的小鼠根据免疫缺陷程度可以分为BALB/c-Nude、SCID、NOD/SCID、NSG及NCG小鼠。其中NSG、NCG小鼠不但缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤(natural killer, NK)细胞，而且细胞因子信号传递能力缺失，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，因此也可以重建人的血液和免疫系统[47]。通常在小鼠体内重建人类免疫系统的方法包括：(1)外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)人源化小鼠，即将人PBMC移植到免疫缺陷小鼠体内，但PBMC小鼠只有T细胞功能，缺乏树突状细胞(dendritic cell, DC)功能，因此无法用于评价多肽及RNA类肿瘤个性化疫苗[48]；(2)CD34人源化小鼠，即将人脐带血来源的CD34+造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，人造血干细胞在小鼠体内可分化为T细胞、B细胞、DC细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞类型，因此CD34+人源化小鼠免疫系统功能更完全，目前已经被广泛用于HIV等感染性病毒的机制研究及临床评价中[49]。随着肿瘤免疫疗法研究热度不断提升，美国JAX实验室及Crown Bio公司等也在CD34+人源化小鼠中移植人肿瘤细胞系，用于评价PD-1等免疫检查点抗体药物的药效[50]。这一突破使得利用人源化小鼠评价免疫治疗成为可能，弥补了PDX模型免疫治疗评估的最大短板，成为目前少有的能在体外活体模拟评价人肿瘤免疫治疗的模型，有望成为未来免疫治疗个体化评估的模型。

以上3种模型最大的优点是肿瘤细胞来源于高度个体化的肿瘤患者，极大程度保证了肿瘤异质性的反应，同时尽可能保留了肿瘤微环境中的间质和免疫成分，无论对于胰腺肿瘤的基础研究还是转化研究都是非常重要和必须的，也只有依赖这样特殊的模型，胰腺癌的研究才有可能摆脱既往低效和无用的传统，真正给胰腺癌的治疗带来希望。

三、新模型在胰腺癌研究中的应用

1．类器官：2013年，Clevers团队率先利用来自小鼠胰腺的组织细胞在以RSPO1为基础的培养基中培养出芽囊样结构，并可以诱导其分化为导管细胞和内分泌细胞，被认为是最早的胰腺组织类器官[51]。2015年1月Clevers团队在《Cell》杂志上率先报道胰腺肿瘤类器官可以从切除或活检肿瘤组织中快速建立并长期保存，并表现出导管样病变和肿瘤不同阶段的特异性[52]。2015年10月 Muthuswamy团队在《Nature Medicine》杂志首次报道在类器官上证实K-ras和TP53突变可以导致正常胰腺细胞癌变，并预测肿瘤类器官可用于药物筛选和个体化治疗[53]。2018年5月Tuveson团队在《Cancer Discovery》首次报道构建了规模化的胰腺癌类器官库，并系统评估了常用化疗药物在类器官和人群间反应的相关性，最终找出了可以用于临床药效预测的表达谱[54]。2019年11月 Clevers团队再次在《PNAS》杂志报道了胰腺癌类器官库用于临床前潜在有效药物库筛选的研究，发现了一些目前临床上尚未试用的敏感药物，并强调了个体化方法对癌症有效治疗的重要性[55]。以上多个重量级的研究证实胰腺类器官体外培养的可行性，并证明了其在临床转化研究中的优势。另外一些学者则在尝试不断完善胰腺类器官模型，以便应用于更多的研究。2018年3月Seino等[56]在《Cell Stem Cell》上报道了胰腺肿瘤类器官和不同间质细胞共培养的模型，应用该模型确定了两种可逆的CAF亚型，成功揭示肿瘤和不同间质细胞的交互作用。2019年2月Tuveson团队在《Cancer Discovery》上报道使用类器官和小鼠模型确定肿瘤分泌的TGF-β和IL-1是促进CAF异质性的重要配体，证明IL-1诱导LIF表达和下游JAK/STAT活化，产生炎症性CAFs，TGF-β通过下调IL-1受体表达和促进向肌成纤维细胞分化来拮抗这一过程，为抗间质治疗提供了策略[57]。而 James团队在此基础上加入了免疫细胞，形成了肿瘤细胞、CAF和免疫细胞共存的最接近活体情况的类器官模型，并在其中评价了免疫检查点阻断治疗效果，为胰腺癌体外类器官模型做出了有意义的探索[58]。

2．PDX：肿瘤特性和所使用免疫缺陷小鼠的类型是影响PDX建模成功率的主要因素。2011年Garrido-Laguna团队利用裸小鼠进行皮下移植的69例胰腺癌成功率为61%[59]，2013年Mattie团队利用SCID小鼠进行皮下移植的12例成功率为67%[60]，2019年笔者所在课题组利用NSG小鼠进行皮下移植的121例成功率达71.1%[61]。进而，多个团队利用胰腺癌PDX高成瘤率的特点进行了广泛的临床前药物筛选和个体化治疗研究。早在2006年Viqueira团队就建立了一个胰腺肿瘤PDX平台来测试一些具有转化前景的药物，并报道了表皮生长因子受体和磷酸化表皮生长因子受体的表达与某些药物反应之间的关联[62]。2008年Smith团队使用了Freiburg PDX库(由400个裸鼠皮下生长的人类肿瘤模型组成)测试吉西他滨和抗VEGF抗体(HuMV833)的药效[63]。2015、2016年Lohse团队利用PDX小鼠研究了聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制剂olaparib(AXD-2281)对BRCA1/ BRCA2突变胰腺癌放化疗敏感性影响的研究，证明其对铂类更敏感[64-65]。另外一系列针对肿瘤干细胞的药物drozitumab[66]和AZD7762(Chk1抑制剂)[67]先后在PDX模型上被证实可以抑制胰腺肿瘤生长。此外，肿瘤间质对药效影响的评估也成为PDX的另一重要用途。2011年Von Hoff团队利用裸鼠构建了一个被称为PancXenoBank的PDX平台，利用该平台发现吉西他滨联合白蛋白紫杉醇能显著减少肿瘤组织中的间质含量，进而提高肿瘤组织中吉西他滨的浓度(2.8倍)，该方案成为目前胰腺癌治疗最有效的方案之一[68]。Valles团队利用NOD/SCID小鼠PDX模型测试了Ibrutinib(PCI-32765，BTK抑制剂)抑制纤维炎症反应的作用[69]。 Rajeshkumar等[70]甚至利用PDX模型研究了苯甲双胍、二甲双胍和丙酮酸脱氢酶抑制剂二氯乙酸对胰腺癌的抑制作用。在个体化治疗方面，有包括丝裂霉素C和顺铂、替西莫司(mTOR抑制)和salirasib与吉西他滨等多个治疗有效并长期生存的个例被报道[59,62]，随着PDX应用的更加广泛，个体化治疗的成效将更加明显。

3．Hu-PDX：目前尚未有利用Hu-PDX研究胰腺癌免疫治疗效果的报道，但其在其他实体瘤研究的经验可以提供借鉴。将人外周血单个核细胞或成熟的免疫细胞亚群经静脉注入受照射的NOG或NSG小鼠体内后，由循环中可检测到人T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞，并被证明可以用于评价单克隆抗体、细胞因子治疗(IL-2)、免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blockade, ICB)和DC疫苗的作用[48,71-72]。抗碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX, CAIX)单克隆抗体与IL-2联合应用可通过诱导人NK和T细胞反应抑制肾癌的进展。在PBMC人源化小鼠模型中也观察到nivolumab、阿替唑单抗、彭布罗单抗和乌鲁单抗的抗肿瘤活性[73]。在PBMC人源化小鼠模型中比较DC疫苗制剂效果，并评估黑色素瘤相关抗原特异性免疫应答和黑色素瘤抑制功能[74]。然而移植物抗宿主反应(graft versus host reaction, GVHR)的发展和小鼠存活率低限制了这些模型在评估癌症免疫治疗有效性方面的应用[75]。利用人CD34+造血干细胞建立人免疫系统可以克服GVHR的障碍。在小鼠主要组织相容性复合体匹配的情况下，干细胞能够适应小鼠的环境，发育成一个比较完整的人免疫系统。在胎肝造血干细胞生成的人源化小鼠的循环中检测到人辅助T细胞、细胞毒性T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞和DCs[76]。进而在肝细胞癌PDX培养过程中发现细胞毒性T细胞和NK细胞的数量和比例下降，而从肿瘤中分离出来的TIL显示出受肿瘤改造的表型，包括免疫检查点表达增加，细胞因子和细胞毒蛋白产生受损；同时在这个模型还观察到了免疫检查点抑制剂的不良反应，这与临床研究一致[76]。此外，在脐血造血干细胞生成的人源化小鼠模型中，nivolumab通过增强抗肿瘤T细胞反应、增加肿瘤中GrB+或IFN-γ+CD8+细胞和降低体内HLA-DRlow髓样细胞的比率来抑制MDA-MB-231细胞和CRC172细胞的生长[77]。与单用nivolumab相比，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂OKI-179和nivolumab联合应用进一步抑制肿瘤的生长，表明HDAC抑制剂可以改善体内的抗肿瘤免疫应答[77]。迄今为止，越来越多的研究表明在抗PD-1和抗CTLA-4治疗后，人源化小鼠体内的人PDX肿瘤发生了退行性改变[71]，表明人源化免疫肿瘤模型可以作为肿瘤免疫治疗或联合免疫治疗研究的新兴平台。

四、展望

研究模型的进步是推动肿瘤学发展的重要动力。2D细胞体外培养技术的成熟使肿瘤的基础细胞分子研究成为可能，多种“基石”类的化疗药物得以发明。PDX模型的出现使研究肿瘤和机体间相互作用成为可能，为多种需要在体内代谢的抗肿瘤药物评估提供了帮助。而新一代类器官和人源化PDX模型的出现，使研究者可以在高度保留组织学特性、遗传学特征和异质性的同时，在体外重建肿瘤微环境信息，包括成纤维细胞、细胞外基质和免疫细胞，而这些特性的缺失正是既往胰腺肿瘤研究模型效率低下的重要原因。虽然这些模型还有需要完善的技术细节，在胰腺癌中的应用还需进一步探索，但相信随着越来越多研究者的应用，胰腺癌的基础和转化研究必将迎来突破。

利益冲突作者声明不存在利益冲突